酶联免疫吸附试验.docVIP

PAGE PAGE 3 实验三 酶联免疫吸附试验（ELISA） 一、实验目的 了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。 二、实验原理 将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。 常用酶及底物 常用酶 底物 加终止液前颜色 加终止液后颜色 辣根过氧化物酶（HRP） RZ3.1 碱性磷酸酶（AP） 邻苯二胺（OPD） 四甲基联苯胺（TMB） 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 橙黄色 蓝色 黄色 棕黄色 黄色 黄色 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用的三种类型： 　 1、间接法测抗体（间接ELISA） 间接法用于测定抗体。它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。 2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA） 双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。底物的降解量＝抗原量。 3、竞争ELISA 竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。 三、主要仪器及试材 以伪狂犬全病毒（PRV）间接酶联免疫吸附试验（PRV－ELISA）为例。 使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含: 1、包被抗原的微孔板 ；2、阴、阳性对照血清； 3、抗猪IgG-HRP结合物； 4、洗涤液；5、底物A液、B液；6、终止液 ；7、样品稀释液 本实验所需仪器和试剂： 1、酶联免疫测定仪 2、已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白） 3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清 4、酶标抗体（E-Ab）：兔抗猪IgG-HRP 5、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO3，2.93g NaHCO3，加ddH2O至1000mL 6、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4） ）： 8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g KH2PO4，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH2O至1000mL。 7、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL 8、底物液（TMB-H2O2）： 磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）：25.7mL 0.2mol/L Na 2HPO4，24.3mL 0.1mol/L 柠檬酸液，加50mL ddH2O。 TMB母液：0.2g TMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。 底物液（TMB）：新鲜配制。TMB母液用底物缓冲液按1∶20的比例稀释，每毫升底物液加入0.2μL 30% H2O2。 9、终止液：0.25% 氢氟酸 四、实验方法与步骤 （一）试剂配制 1、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO3，2.93g NaHCO3，加ddH2O至1000mL 2、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4）： 8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g KH2PO4，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH2O至1000mL。 3、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL。 4、底物液（TMB-H2O2）： 磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）：25.7mL 0.2mol/L Na 2HPO4，24.3mL 0.1mol/L 柠檬酸液，加50mL ddH2O。 TMB母液：0.2g TMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。 底物液