枯草芽孢杆菌植酸酶的性质研究及产酶基因的克隆和序列分析-微生物学专业毕业论文.docxVIP

摘 摘 要 本研究从118份样品中分离到一株产植酸酶的枯草芽孢杆菌(命名为 Bacillus．幽tj』拈髓NB02)。其发酵液经乙醇沉淀、硫酸铵分级沉淀及Sephadex G-100 柱层析等步骤后分离纯化了该酶，纯化倍数约为31．5倍，回收率为13．o％。酶学性质研 究表明：该酶为单体酶，SDS—PAGE测得的表观分子量约为42KD；37C下以植酸钠为底物 的‰值为0．5tmol／L；酶反应的最适温度为60℃，80℃作用lOmin剩余酶活为61％；最 适pH为7．0，在pH6．0～lO．0范围内稳定；酶活性及稳定性都依赖c矿存在，螯合剂及 各种金属离子对酶活都有不同程度的抑制作用。lmM的Hg“、№“、Cu”、gn2+、Ba2+有中 度抑制作用，lmm的EDTA、cd+具有很强的抑制作用，剩余酶活在20％以下。根据国际 基因库(GenBank)中注册的芽孢杆菌植酸酶phyC基因序列设计了一对引物，PCR扩增 获得了一条长约1．2kb的特异性PCR扩增条带。将此PcR扩增片段定向克隆到pUCl8质 粒的多克隆位点，构建了含有目的基因片段的重组质粒，并转化到JMl09大肠杆菌载体 菌中获得了阳性克隆菌株。重组质粒中外源片段的DNA序列测定表明，该片段含有植酸 酶phyC基因的完整序列，基因全长1152bp，编码383个氨基酸，5’端有一编码26个 氨基酸的信号肽序列。将该基因与Kerovuo(1998)所报道的芽孢杆菌植酸酶phyC基 因(GenBank Accession：AF029053)进行比较，同源性达92．4％；两条氨基酸序列相比， 同源性达93．7％。目前已将Bacillus．subti]is WHNB02植酸酶phyC基因序列及其相应 的氨基酸序列在国际基因库中注册，注册号分别为AF220075和AA043434．1。 关键词：枯草芽孢杆菌，植酸酶，性质，克鏖，测序 一、前言 一、前言 1概述 磷是动物必需的常量矿物元素，它既是机体重要的结构成分，又参与许多重要的生 理生化过程，发挥不可替代的功能。如果饲料中缺磷，会导致畜禽生长缓慢，饲料转化 率和瘦肉组织的积累降低，对骨骼的发育不利“1。为此饲料中磷是仅次于能量和蛋白质 的第三位营养素，磷的添加对配合饲料生产成本及产品质量有重要影响。猪禽饲料的主 要来源是玉米、豆饼粕、谷糠、绵籽饼粕等，它们所含的磷约40～70％以植酸磷的形式 存在，由于猪和禽等单胃动物体内很少有能分解植酸磷的酶存在，大量的植酸磷不能被 利用而从粪便中排除。美国肯塔基大学经过10年研究证实，猪只能利用玉米中磷的10～ 2096、豆饼中磷的25～35％，其它的磷则随粪便排泄到环境中。。”。所以，为满足动物生 理代谢及生长发育的需要，则必须在饲料中添加无机磷。这样，一是增加了饲料成本。 二是造成了磷源的大量浪费且大量的磷以植酸磷的形式从粪便排除，对环境造成极大的 污染。三是植酸是一种抗营养剂，易与金属和蛋白质结合，它的大量存在，除降低了动 物对矿质元素和蛋白质的吸收外，同时它也降低了消化酶的活性，因而也影响了碳水化 合物和脂肪的吸收㈣。据报道，目前世界上每年至少有100万吨的磷随废水排出来， 其中3096以上是养猪业所为撬”。磷存在于土壤表面，不仅不能在土壤中渗透和扩散，还 能与铜、铝、钙等元素形成不溶性复合物保留在土壤中。如果土壤中磷大量积聚并溢 出，将随着土壤的侵蚀流动，造成自然界水资源的污染。据我国部分省市的调查，一些 省市目前大部分地区土壤磷超过正常值10倍以上，集约化猪场、鸡场排除的磷已成为 农业的危机，一些植物如花生，由于土壤磷超过正常值，导致卷叶、枯死。一些地区从 环保的角度对集约化畜牧场已提出了限制捧磷的要求旧。 植酸酶(Phytase)即肌醇六磷酸水解酶(Myo—inositol hexaphosphate phosphohydrotase)，是催化植酸(即肌醇六磷酸)及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷 酸盐)的一类酶的总称蛳。大量研究表明，在猪、禽日粮中添加植酸酶，可使饲料中 磷的利用率提高40％～60％，粪便中磷的排出量减少30％～50％左右，同时降低植酸磷 对其它微量元素及蛋白质利用率的影响睁“。 研究发现，植酸酶广泛存在于植物、动物组织和微生物中“”。目前，研究较多的是 微生物产生的植酸酶，对其进行的分离纯化及理化性质研究表明，它们可能是饲用植酸 酶的最佳来源。其中，以对真菌产生的酸性植酸酶研究最多“”1，研究表明，该酶由phyA、 phyB编码，目前已构建各种基因工程菌并得到高效表达，并进行了大规模的发酵生产， 2 大大提高酶产量和降低生产成本。由于酸性植酸酶其酶催反应的pH有效作用范围在 大大提高酶产量和降低生产成本。由于酸性植酸酶其酶催反应的pH有效作用范围在 2．