黄瓜幼果cDNA文库构建与部分ESTs分析-蔬菜学专业毕业论文.docxVIP

血 黄瓜幼果 cDNA 文库构建与部分 ESTs 分析 蔬菜学专业研究生 梅茜 指导教师 张兴国研究员 摘要 黄瓜(Cucumis aat;vus L.) 原产喜马拉雅山南瘾的印度北部地区 I11，是一种世界性的重要 蔬菜，为大众喜爱，有很高的营养价值.印度于 3∞0 年前开始栽培黄瓜.随着南亚民族的迁 移和往来，黄瓜由原产地向东传播到中国南部，东南亚各国及日本等，在我国已有 20∞多年 的栽培历史.黄瓜是喜温但不耐高湿的一年生攀缘性草本植物，从播种出茧到采搞的时间较 短，是最适合周年生产、均衡供应的一种瓜类.常用的植物遗传育种的原理与方法在提高黄 瓜性状方面已失去了原有的优势，即设期通过表型值来估计育种值，使得性状的遗传进展越 来越小.随着分子遗传学原理和生物技术方法的发展，从分子水平上对植物的生产性能进行 改良有了可能，从而为植物分子育种打下基础。由于种内资源的有限 F 利用羹因工程将是今 后黄瓜品种改良中重组远缘有用基因的有效手段，对黄瓜基因进行研究 v 可为进一步的分子 育种打下基础.黄瓜果实是其经济产品器官和食用部位，脆徽、 :;具有丰富的营养价值阳，它 的生妖发育过程、物质合成与积累、外部形态特征和内在品质性状等无不影响其产品糖宵的 产量构成和经济价值.探讨黄瓜果实的生长发育特点，尤其是探讨黄瓜果实生长发育过程中 的基因表达与调控方式，可以为今后改良黄瓜的结实习性、促进果实生长 J键商经济产量和 改善果实晶质等方面奠定基础。本实验以黄瓜幼果为实验材料，以 λTriplEX2为载体，构建 了黄瓜 cDNA 文库，通过随机挑选部分克隆进行 EST 溅序后，进行网上同源性比较和基因功 能分析，得出以下结论: 一、黄瓜 (Cucumissativus L.)cDNA 文库的构建 采用上海生工的Trizo l 试剂盒提取黄瓜的总 RNA ，1%琼脂糖凝胶电泳的结果显示 z 提 取的黄瓜 RNA 的 28s、189、5s 条带较为清晰，说明mRN A 受分解的程度小. 西南农业大学硕士学位论文 - 采用Promega 公司的 PolyATtract@ mRNA lsolation System III 从 RNA 中分离提取 mRNAt 经紫外分光光度计测定， mRNA 纯度较高，能够满足实验的需要。 采用 SMART IV Oligonucleotide 和 CDSII的， PCR Primer 为引物，在 PowerScript? Reverse Transcriptase 酶的作用下合成第一链 cDNA 并进一步合成第二链 cDNA ，经PCR 产 物纯化和弱 I 酶切后用 CHROMA SPIN400 column 柱进行分级分离以去除小于 400bp 的 cDNA 片段和一些核糖体 RNAt 浓缩回收后按比例与载体 λTriplEx2 (带有项酶切末端〉连 接.采用 Stra饵gene 公司的 Gigapack@ III Gold-7 packaging extract 试剂盒进行包装，获得 cDNA 文库。 包装产物中加入终浓度为 7%的 DMSQ ，分装后置于-80C保存。 -、 文库质量的鉴定 将得到的 cDNA 原始文库按]: 10 的比例进行稀释，将文库的稀释液与 XLl-BJue 菌株 的感受态细胞混匀，加入 0.7%的顶层结养基以及 I町、G 和 x-gallt 倒平板并在 37C下过夜培养， 计算噬菌斑数目及蓝白噬菌斑数量.得出噬菌体 cDNA 文库的漓度为 1.165X 106pfulml，重组 率 94.42%。根据载体的多克隆位点，用EcoRI 和 HindIII 进行双酶切，得到该文库的大多数 外源插入片段平均大小在 SOObp 以上。采用相同方法测定 cDNA 扩增文库的滴度约为 1010 pfulmlo 三、 EST 测序 从 cDNA 文库中随机挑选部分克隆，经 EcoRI 和 Hindm 双酶切鉴定，进行 1%琼脂糖 凝胶电泳，结果显示:大部分克隆都有外源片段的插入.本实验共测了 141 个阳性克隆，采 用 λTriplEx2载体多克隆位点领 IA 端的 pTri时I Sequencing Primer (CTCCGAGATCTGGAC) 作为测序引物，即从 cDNA 的 5 端进行测序，去掉低质量 EST 序列后剩余 139 条，测序成 功率为 98.58%，全长序列有36 条，占 25.53%CT 最长的 EST 为 706bp，平均长度562.74bp ， 长度峰度在 6ωbp 左右， 79.43%的 EST 氏度集中在 SOO-700bp。 四、测序结果分析 从分析结果看， EST 序列中有部分序列为同一基因.这些序列经 clus创 W 软件比较后拼 接