慢病毒转染胸苷磷酸化酶基因对5-脱氧氟尿苷抑制人结肠癌细胞活性的影响-外科学专业毕业论文.docxVIP

中文摘要英文缩略词 中文摘要 英文缩写 TP 英文全称 thymidine phosphorylase 中文全称 胸苷磷酸化酶 5-FU 5- fluorouracil 5-氟尿嘧啶 5’-DFUR 5-deoxy -5- fluorouridine 5-脱氧氟尿苷 cDNA complementary Deoxyribonucleic 反转录脱氧核糖核酸 acid MTT 3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 3-（4，5-二甲基噻唑-2） -diphenyl-tetrazolium bromide -2，5-二苯基四氮唑溴盐 IC50 HPLC 50% inhibitory concentration high performance liquid 半数抑制浓度 高效液相色谱法 chromatography Polybrene hexadimethrine bromide 聚凝胺 BSD Blasticidin 杀稻瘟菌素 DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 mRNA messenger ribonucleic acid 信使核糖核酸 PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 中文摘 中文摘要 PAGE PAGE 10 慢病毒转染胸苷磷酸化酶基因对 5-脱氧氟 尿苷抑制人结肠癌细胞活性的影响 学位专业：外科学 研 究 生：高 庆 导 师：张继民 教授 摘 要 研究背景 胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）即血小板衍化血管内皮细胞 生长因子（platelet-derived endothelial cell growth factor，PD-ECGF）是嘧啶核苷 代谢过程中的一个关键酶，能可逆性催化胸腺嘧核苷转化生成胸腺嘧啶和 2-脱氧 -D-核糖-1-磷酸，其在体内具有明显的促血管新生和抗细胞凋亡作用。TP 同时又 是 5-氟尿嘧啶（5- fluorouracil, 5-FU）前体药物 5-脱氧氟尿苷（5-deoxy -5- fluorouridine，5’-DFUR，氟铁龙）和卡培他滨（capecitabine，希罗达）等转化为 5-FU 的一个关键限速酶，与肿瘤的化疗关系密切。已经证实，在肿瘤组织中 TP 的活性明显高于周围的正常组织，但在不同的肿瘤组织中，TP 表达的具体部位、 活性和作用却不尽相同。近年来，很多国内外学者研究和我们的前期实验研究均 发现人结直肠癌组织及肝转移组织中 TP 并非癌细胞而主要由间质的肿瘤相关巨 噬细胞（tumor-associated macrophages，TAM）表达。在结肠癌细胞不表达 TP 的情况下应用 5-FU 前体药物，5’-DFUR 在组织-细胞中如何转化，是目前仍未解 决的问题。而提高结直肠癌组织中尤其是癌细胞中 TP 的表达水平，对改善结直 肠癌患者对氟尿嘧啶类药物化疗的敏感性有重要的临床意义。本实验通过慢病毒 转染 TP cDNA 至人结肠癌细胞 SW480 和 LOVO 中，通过抗药基因筛选及流式 细胞仪检测确定得到高表达 TP 的细胞株，探讨转染前后对氟尿嘧啶类药物敏感 性、转化 5’-DFUR 生成 5-FU 能力的变化及临床意义。 广州医 广州医学院硕士学位论文 目的 探讨转染TP cDNA对5’-DFUR抑制人结肠癌细胞SW480和LOVO作用的影 响。 方法 构建包含TP cDNA全长的真核表达载体，用慢病毒包装后转染人结肠癌细胞 SW480、LOVO，以流式细胞仪检测转染效率。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）检测转染前后肿瘤细胞转化5’-DFUR生成5-FU 能力的变化；四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测转染前后SW480和LOVO对 5’-DFUR药物敏感性的变化。 结果 转染TP基因并传代5代后SW480和LOVO细胞的转染效率均在95%左右。 HPLC法检测显示SW480-TP、LOVO-TP细胞转化5-DFUR为5-FU的能力分别是 亲代细胞的2倍和10倍，差异有统计学意义（p0.01）。转染TP cDNA后，5’-DFUR 对SW480细胞半数有效剂量（IC50）由亲代细胞的（1640.67±53.25）μM下降为 （587.2±17.28）μM，差异具有统计学意义（P0.01），而仅转染载体细胞的IC50 为（1630.12±45.91）μM，与亲代细胞相比差异无统计学意义（P0.05）。同时， 转染TP cDNA后，5’-DFUR对LOVO的IC50由亲代细胞的（1607.33±56.77）μM下 降为（1087.67±89.05）μM，差异具有统