高通量测序(NGS)数据分析中的质控.docVIP

高通量测序错误总结 一、生信分析部分 1）Q20/Q30 碱基质量分数与错误率是衡量测序质量的重要指标， 质量值越高代表碱基被测错的 概率越小。 Q30 代表碱基的正确判别率是 99.9% ，错误率为 0.1% 。 同时我们也可以 理解为 1000 个碱基里有 1 个碱基是错误的。Q20 代表该位点碱基的正确判别率是 99% ， 错误率为 1% 。 对于整个数据来说，我们可以认为 100 个碱基里可能有一个是错误的 , 在碱基质量模块报告的坐标图中，背景颜色沿 y- 轴将坐标图分为 3 个区：最上面的绿 色是碱基质量很好的区， Q 值在 30 以上。中间的橘色是碱基质量在一些分析中可以接 受的区，Q 值在 20-30 之间。最下面红色的是碱基质量很差的区。 在一些生信分析中， 比如以检查差异表达为目的的 RNA-seq 分析，一般要求碱基质量在 Q 在 Q20 以上就 可以了。 但以检查变异为目的的数据分析中，一般要求碱基质量要在 Q30 以上。 一般来说，测序质量分数的分布有两个特点： 测序质量分数会随着测序循环的进行而降低。 有时每条序列前几个碱基的位置测序错误率较高，质量值相对较低。 在图中这个例子里，左边的数据碱基质量很好，而右边的数据碱基质量就比较差，需要 做剪切（ trimming ）， 根据生信分析的目的不同，要将质量低于 Q20 或者低于 Q30 的碱基剪切掉。 2）序列的平均质量 这个是碱基序列平均质量报告图。横坐标为序列平均碱基质量值，纵坐标代表序列 数量。 通过序列的平均质量报告， 我们可以查看是否存在整条序列所有的碱基质量都普 遍过低的情况。一般来说，当绝大部分碱基序列的平均质量值的峰值大于 30 ，可以判 断序列质量较好。如这里左边的图，我们可以判断样品里没有显著数量的低质量序列。 但如果曲线如右边的图所示， 在质量较低的坐标位置出现另外一个或者多个峰，说明测 序数据中有一部分序列质量较差，需要过滤掉。 3）GC 含量分布 这个是 GC 含量分布报告图。 GC 含量分布检查是检测每一条序列的 GC 含量。将 样品序列的 GC 含量和理论的 GC 含量分布图进行比较，用来检测样品数据是否有污染 等问题。 理论上， GC 含量大致是正态分布， 正态分布曲线的峰值对应基因组的 GC 含 量。 如果样品的 GC 含量分布图不是正态分布，如右图出现两个或者多个峰值，表明测 序数据里可能有其他来源的 DNA 序列污染，或者有接头序列的二聚体污染。这种情况 下，需要进一步确认这些污染序列的来源，然后将污染清除。 4）序列碱基含量 碱基含量模块是统计在序列中的每一个位置， 四种不同碱基占总碱基数的比例。它 的目的是检测有无 AT、GC 分离的现象， 而这种现象可能是测序或建库的系统误差所带 来的，并且会影响后续的生信分析。 理论上，在随机的 DNA 文库中， G 和 C 含量以及 A 和 T 含量在每个测序循环上应分别相等， 而且整个测序过程稳定不变。 所以碱基含量 的四条线应该是基本平行的水平线（图 A）。而现实中，由于建库 PCR 扩增时 PCR 引 物的最初几个碱基不能很好地和模板 DNA 结合，常常会导致测序结果序列开始的大约 前 10 个碱基位置，碱基含量有较大的波动。这种波动存属于技术误差（图 B）。如果在 整个测序过程中，四条碱基含量线都出现波动，可能是样品库里有过多的接头序列的二 聚体（图 C，D）。在建库过程中，如果加入的接头序列过量，两个接头序列可能会连在 一起，中间没有要测序的插入序列， 形成接头序列二聚体。 这些二聚体可以利用 adapter trimmer 软件去除。 5）过量出现的序列 过量序列模块是查看数据是否有污染的另一种方法。 如果某个序列的数量占全部序列的 % 以上， FASTQC 就定义该序列为 over-represented 。这些 over-represented 序 列通常 标示着污染序列的存在 。这种污染如果是建库测序中的接头序列， fastqc 可以检 测并标示出可能的来源（ possible source ）。但如果污染是由于其他来源的 DNA ，比 如其他生物的 DNA ，FASTQC 就没法判断污染序列的来源。这就需要生信分析人员利 用其他方法找出污染源。 比如将大量出现的序列和 NCBI 的 DNA 数据库进行 blast ，看 看污染序列是否来自其他物种。 6）过量出现的 Kmer 检查是否有接头序列，还可以查看 k-mer 含量。如果有些 k-mer 过量出现，很有可能 有序列污染。过量出现的 k-mer 可能会有三种情况：序列５ －端，序列中间，或者序 列３－端。５’－端过量出现的 k-mer 是建库 PCR 扩增时 PCR 引物无法和 DNA 模板 很