驴新型Cathelicidin的基因克隆、多肽鉴定和功能分析-动物学专业毕业论文.docxVIP

河北师范大学硕士学位论文引 河北师范大学硕士学位论文 引 言 PAGE PAGE 10 引 言 Cathelicidins 是一类一级结构差异显著的抗微生物肽的前体，在几乎所有种类的动 物体内都有发现，在动物先天免疫系统中发挥非常重要的作用[1,2]。其一级结构主要由一 段 N 端信号肽（30 个氨基酸残基左右），紧接着一段高度保守的 cathelin 区（99-114 个 氨基酸残基）和一个序列高度多变的羧基端成熟肽（12-100 个氨基酸残基）区域构成[3]。 Cathelicidins 在循环中性粒细胞和骨髓细胞内的含量最丰富[4],另外还存在于粘膜上皮细 胞和皮肤角质细胞内[5]。 到目前为止，科研工作者们已经从人、猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、袋鼠、猪、牛、 绵羊、山羊、马、狗、鸡、鱼和蛇等动物中鉴定出许多 Cathelicidins[6-8]。依据其二级结 构，这些 Cathelicidins 被进一步分为三组[6]。第一组特征是具有一个两亲性的 α-螺旋结 构（如人、小鼠和牛 BMAP-34）；第二组的特点是富含一种或两种氨基酸（多是脯氨酸 和精氨酸），包括猪 PR-39 和牛 bactenecins；第三组主要呈 β-片层结构，如 protegrins。 除了主要的抗微生物活性外，cathelicidin 还参与创伤修复，诱导血管发生和细胞溶 解，中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞、和 T 细胞的趋化[6,9]。有报道说，人 cathelicidin LL-37 还具有抗肿瘤和抗 HIV 病毒的活性[10]。与这些在宿主防御和抗病中的重要作用相 伴的是，cathelicidins 的过量表达常常与许多疾病的发生有关[11]。因此，进一步研究 cathelicidins 的生物活性和临床用途，无疑将对治疗传染病有很大帮助，并且可以提供 更多新型治疗药物来应对不断出现的抗生素耐药性的问题。目前，cathelicidin 确切的杀 菌机制还不太清楚。尽管如此，人们普遍认为其抗微生物的活性，主要是因为带正电荷 的 cathelicidin 与带负电荷的微生物细胞膜（磷脂）的物理相互作用导致细胞膜破坏。 在此项研究中，我们首次报道了驴 cathelicidin 的基因克隆、鉴定及功能分析。我们 从驴肺 cDNA 文库中克隆出两条编码 cathelicidin 的 cDNAs，一条含有完整的编码区 （Ea-CATH1），另一条只含有部分编码区，但包含完整成熟肽区（Ea-CATH2）。我们 化学合成了根据前体推测出来的 Ea-CATH1 抗微生物肽，并进行了一系列的功能活性分 析，包括抗菌活性、溶血活性和红细胞凝集活性等的筛选。 此外，还研究了 Ea-CATH1 的杀菌动力学和影响其抗菌活性的因素（血清稳定性和 pH 值）。Ea-CATH1 的杀菌效率远高于传统的氨苄青霉素，而且随着浓度的提高，杀 灭金黄色葡萄球菌的效率成倍增高。血清稳定性往往是影响药效的关键因素之一， cathelicidin 抗微生物肽却普遍存在血清不稳定的问题；而 Ea-CATH1 在人血清中的稳定 性超乎我们的想象，其强大的抗菌活性可以在血清中保持 3 天以上。实验证明 pH 值对 Ea-CATH1 的杀菌能力有一定影响，总体上在 pH7.0 附近最强。 为了更好的理解 Ea-CATH1 杀菌作用的机制，我们利用圆二色谱确定了其溶液结 构，并利用扫描电子显微镜观察其对细菌细胞形态的影响。圆二色谱测定的数据显示， Ea-CATH1 在模拟生物膜的溶液中主要表现 α-螺旋结构，但在水中却是无规则卷曲结构。 通过扫描电子显微镜观察发现，Ea-CATH1 可以破坏细菌的细胞壁和细胞膜，从而导致 细菌细胞溶解。 河北师范大学硕士学位论文文献综述 河北师范大学硕士学位论文 文献综述 1 文献综述 Cathelicidin 的研究历史 Cathelicidin的发现可以追溯到1988年，Romeo等人研究牛中性粒细胞裂解液抗菌活 性时分离到一种含有二硫键的环状十二肽[12] 。这种十二肽被鉴定后，紧接着两种另外 的中性粒细胞抗微生物肽被分离纯化出来，它们被命名为bactenecins(以拉丁文bacterium necare命名)。Bac5是一种含有43个氨基酸残基的羧基端酰胺化的多价阳离子肽，而且富 含脯氨酸；Bac7是一种含有60个氨基酸残基的富含脯氨酸的多肽，它的氨基酸序列与前 者差别很大[13]。 1993年，Zanetti 等人从牛骨髓cDNA文库中克隆出Bac5的cDNA序列[14]，由此发现， 尽管十二肽、bactenecins，还有其它结构上不相关的抗微生物肽[15-17]具有结构多样性， 但其实均是紧密相关的同一类蛋白家族成员。此后的分子克隆过