酶法制备L-色氨酸和γ-氨基丁酸-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 陈 龙 2015 年 5 月 20 日 非公开学位论文标注说明 (本页表中填写内容须打印) 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 ■限制(≤2 年) □秘密(≤10 年) □机密(≤20 年) 保密期限 20 年 月 日至 20 年 月 日 审批表编号 批准日期 20 年 月 日 南开大学学位评定委员会办公室盖章(有效) 注：限制★2 年(可少于 2 年);秘密★10 年(可少于 10 年);机密★20 年(可少于 20 年) 摘要 摘要 摘 要 酶作为一种生物催化剂具有高效、温和、环保的优点，在工业生产中可以 作为一种安全环保的生产方式，受到越来越普遍的关注和应用。L-色氨酸是人和 动物重要的必需氨基酸，在医药、食品和饲料添加剂等方面具有广泛的用途。 由于丝氨酸羟甲基转移酶（Serine hydroxymethyltransferase，SHMT）和色氨酸 酶（Tryptophanase，Tpase）两种酶特殊的物理和化学特性，可以利用甘氨酸和 吲哚采用双酶结合联用的方法酶法转化生产 L-色氨酸，将为色氨酸的高效生产 带来新的曙光。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）在食品、医药保健、 饲料加工领域都有广泛的应用前景，其市场需求也越来越大。谷氨酸脱羧酶 （Glutamate decarboxylase，GAD）是一种能够高效专一的催化谷氨酸生产 γ-氨 基丁酸的酶，因此在发酵工业、制药等领域发挥着很重要的作用，但游离态的 谷氨酸脱羧酶在应用上却受到很大的限制，因此对其进行固定化研究和转化过 程控制就成为酶工程的重要课题之一。 为了实现双酶共表达和催化的功能，本文首先构建一株丝氨酸羟甲基转移 酶和色氨酸酶共表达菌株（BL21-pET28a-SHMT-Tpase），并采用 design expert 软件设计和优化了酶活表达诱导条件，考察了 IPTG 浓度，温度和时间等对丝氨 酸 羟 甲 基 转 移 酶 和 色 氨 酸 酶 酶 活 的 影 响 。 根 据 响 应 面 结 果 确 定 BL21-pET28a-SHMT-Tpase 共表达菌株在 0.5 mM IPTG 浓度、33℃条件下诱导 4 h 表达的酶活性最高，丝氨酸羟甲基转移酶和色氨酸酶酶活分别为 5500 U 和 1300 U。并进一步确定了酶法转化条件，实现由甘氨酸到色氨酸的高效转化，当甘氨 酸浓度为 1 g/L 时，转化率为 45.72 %。 另外本文还构建了一株谷氨酸脱羧酶具有纤维素结合域固定化标签的谷氨 酸脱羧酶表达菌株（BL21-pET35b-GAD），并考察了高碘酸氧化和纤维素结合域 亲和吸附等多种谷氨酸脱羧酶的固定化条件，实现由谷氨酸到 γ-氨基丁酸的固 定化高效转化。测定 γ-氨基丁酸含量验证酶活约为 0.9 U，转化率为 100%。此 外，采用近红外光谱在线控制技术监测反应过程，优化了光谱预处理方法，构 建了谷氨酸和 γ-氨基丁酸多元校准模型，实现了产物和底物含量的准确预测。 利用该技术结合酶法固定化转化条件，实现了近红外技术监测酶法转化过程， 描绘了 100 g/L 谷氨酸底物连续酶法转化生成 GABA 过程的反应过程曲线，当选 I 定波长区间为 1567～1789 nm 时，对于 L-谷氨酸外部验证的预测标准偏差为 1.7 g/L，决定系数为 97.81 %；对于 γ-氨基丁酸外部验证的预测标准偏差为 5.14 g/L， 决定系数为 92.91 %，可用于酶法转化过程中预测谷氨酸和 γ-氨基丁酸的含量变 化。 本研究成功构建构建一株丝氨酸羟甲基转移酶和色氨酸酶共表达菌株，和 一株谷氨酸脱羧酶固定化表达菌株，进行酶法转化条件的优化，以及建立转化 过程快速检测方法，为 L-色氨酸和 γ-氨基丁酸的酶法转化和近红外在线监测提 供了理论和实践基础。 关键词：酶法转化；丝氨酸羟甲基转移酶；色氨酸酶；谷氨酸脱羧酶；近红外 光谱技术 II Abst Abstract Abstract Enzyme is a kind of special catalyst has many advantages, which catalyz