黄连素的提纯及其对三种水产动物类致病菌的抑菌特性研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

摘要 摘要 I I 摘 要 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）以及嗜水 气单胞菌（Aeromonas hydrophila）为水产养殖业常见的病原菌，近年来由其引发的细菌 性疾病不仅给养殖业带来了巨大的经济损失，还威胁着人类的健康。本实验以黄连为材 料，研究黄连素的最佳提纯工艺以及其对三种病原菌的抑菌作用，同时探讨黄连素的抑 菌机制，为黄连素在细菌性疾病防治中的应用提供依据，也利于进一步深究黄连素的抑 菌机理。 利用传统回流、微波、超声等 6 种方法提取黄连素，并用沉淀法与大孔树脂法纯化， TLC、HPLC 测定，结果表明 80%乙醇，料液比 1：20，T= 90℃，t= 90min 回流提取 2 次黄连素得率为 8.3%，经大孔树脂-沉淀法纯化、HPLC 测定，黄连素纯度为 86.25%。 测定黄连素对三种供试菌 MIC、MBC，并运用电镜扫描黄连素对供试菌的作用情 况，结果发现，黄连素对三种副溶血弧菌、溶藻弧菌有着强烈的抑制效果，其 MIC (Minimal inhibitory Concentration) 、MBC (Minimal Bactericidal Concentration) 值分别 为：0.391 g/L、0.391 g/L；0.391 g/L、0.781 g/L；对嗜水气单胞菌的抑制作用相对较弱， MIC、MBC 分别为：0.781 g/L、1.563 g/L。电镜观察发现，黄连素作用下的供试菌菌体 黏连、破碎、内容物流出等，明显非正常死亡，且黄连素对菌体的破坏程度随着黄连素 浓度增加而增加。 抑菌圈法测定黄连素对革兰氏阳性菌与阴性菌的作用差异，氧电极法测定不同浓度 黄连素对三种供试菌的呼吸作用影响，并据吸光值绘制黄连素作用下供试菌一步生长曲 线，SDS观察黄连素对供试菌蛋白表达的影响，以黄连素代替 EB 核酸进行核酸 电泳。结果表明，黄连素作用下，①革兰氏阳性菌与阴性菌的抑菌圈无明显差异；②三 种供试菌单位时间内耗氧量微有降低但无明显规律；③供试菌潜伏期延长 2 h 至 4 h 不 等，但延长后部分菌体仍存在对数期；④蛋白浓度降低，且电泳显示部分条带未表达； ⑤黄连素可以像 EB 一样插入到 DNA 中。 综上，本文对黄连素的提取及其对水产动物类致病菌的作用进行了较为系统的研 究，不仅获得了黄连素的最佳提取工艺，还发现其对副溶血弧菌、溶藻弧菌以及气单胞 菌有着良好的抑菌效果，可以应用于水产养殖业细菌性疾病的防治中，抑菌机制方面， II II 黄连素在细菌潜伏期与活跃的 DNA 发生结合形成了某种复合物，从而抑制了细菌正常 的分裂增殖。 关键词：黄连素；提纯；水产动物类致病菌；抑制 Abs Abstract PAGE PAGE IV Abstract Vibrio parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila and Vibrio alginolyticus were common aquatic pathogenic bacteria, which not only caused numerous losses of aquaculture industry, but also threatened human beings‘ health. In this paper, the best methods of extraction and purification of Berberine were tested and the antibacterial effect also was also researched to prevent and cure bacterial diseases. Six extraction methods, including Traditional backflow, Microwave and Ultrasonication and so on, were tested to choose the best way of extraction. Precipitation and Macroporous Resin (MR) were used for the purification. The results showed that, in laboratory conditions, the acquire rate of Berberine could reach to 8.3﹪by reflux extraction at 80% ethanol, 1:20, T = 90℃, t = 90min, 2 times. Besides,