枯否细胞分离培养及其在同种肝移植免疫中作用机制初步探讨-外科学专业毕业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 枯否细胞分离培养及其在同种肝移植免疫中 作用机制初步探讨 研究生: 张长习 导 师: 谢文彪 主任医师 中 文 摘 要 第一部分 大鼠及人肝脏枯否细胞的分离纯化和培养 目的： 改进大鼠肝枯否细胞（kupffer cell,KC）分离、纯化和培养技术，探讨从人 体肝脏手术标本中分离、纯化和培养枯否细胞的可行有效方法，以便进一步研究 人体枯否细胞的生物学功能。 方法： 24 只 SD 大鼠肝脏及 6 例人体肝脏手术标本用于本实验。大鼠肝脏通过门静 脉、人体肝组织通过肝静脉灌注预灌流液，灌注后肝脏标本采用离体胶原酶灌注 消化获得细胞悬液，然后通过差速离心去除细胞悬液中的肝实质细胞，获得富含 KC 的肝非实质细胞。改传统 PBS 重悬肝非实质细胞为 25%percoll 重悬，从而形 成新 percoll 梯度为:PBS、含肝非实质细胞的 25%percoll、50% percoll，然后 通过不连续密度梯度离心分离获得枯否细胞，最后选择性贴壁进一步纯化。应用 吞噬功能实验对 KC 进行鉴定，台盼蓝拒染实验判定细胞活力。 结果： 最终获得的枯否细胞的产量分别为：大鼠 3.1±0.5×106/g 肝脏，人体肝脏组 织为 2.3±0.4×106/g 肝脏，细胞活力和纯度均达 90%。 结论： 本实验建立的大鼠及人体肝脏枯否细胞分离方法，简便经济，效果稳定，获 得的枯否细胞可用于进一步的实验研究。 第二部分 人枯否细胞在同种肝移植免疫中作用机制初步探讨 目的： 通过将枯否细胞和/或同种异体混合淋巴细胞直接接触共培养，观察共培养 细胞 KC 和 PBMC 表面 HLA-G 蛋白表达，测定培养上清液中一氧化氮和细胞因子的 变化，观察 KC 对淋巴细胞增殖的影响，探讨枯否细胞在共培养体系中的作用及 机制，试图了解枯否细胞在肝移植免疫耐受中的功能作用，为进一步利用枯否细 胞特异性诱导肝移植耐受的实验与临床研究提供依据。 方法： 分离健康志愿者及接受肝脏手术者的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells ，PBMC，分别记为 Pr 及 Pd），各 6 例。将枯否细胞和/或异 体混合淋巴细胞共培养作为实验组，包括：PP 组，即 Pr+Pd;KP 组，即 Kc+Pr;KPP 组，即 Kc+Pr+Pd，将单独 Pr,Pd,Kc 及 Kc+Pd 培养组作为对照组。其中 24 孔板 培养组用于收集细胞和培养上清液，96 孔板培养组用于 MTT 实验。分别于培养 后第 1、2、4、6 天收集细胞上清液，置于－80℃冰箱保存备用。第 6 天培养结 束时分别收获培养的枯否细胞和外周血单个核细胞。应用免疫组织化学技术检测 HLA-G 在枯否细胞和单个核细胞表面的表达；应用硝酸还原酶法测定上清液中 NO 的浓度，用双抗体夹心 ABC-ELISA 技术测定上清液中干扰素-γ、白介素-10 和 转化生长因子-β1 的浓度；用 MTT 法测定 PP 组及 KPP 组中淋巴细胞增殖。 应用 SPSS13.0 统计软件进行统计分析。所有实验结果以均数±标准差（ x ± S）表示，组间比较采用单向方差分析法（One－way ANOVA），组间两两比较 采用 SNK（Student-Newman-keuls）-q 检验，以 p＜0.05 为具有显著性差异统计 学标准。 结果： 1、在培养第 6 天，实验组及对照组中枯否细胞和外周血单个核细胞表面均 未检测到 HLA-G 的表达。 2、含枯否细胞的混合培养组细胞培养上清液中，NO 的产量显著上升，且 在任一相同时间点，KPP 组显著高于 KP 组（P＜0.01），并且均在第 4 天达峰值， PP 组也呈相同变化趋势，但均低于同时点的 KPP 组、KP 组产量（P＜0.01），对 照组中仅 Kc,Kc+Pd 组检测到 NO 的少量分泌。在第 1、2 天两个时间点，KPP 组中 IFN-γ的含量高于 PP 组而在随后两个时间点，PP 组中 IFN-γ值均高于同 时点的 KPP 组和 KP 组，该三组中 IFN-γ的变化趋势相似，均在第 4 天达最高 值，随后下降。对照组中未能检测到 IFN-γ的表达。PP 实验组细胞培养上清夜 中第 1 天未能检测到 IL-10，在以后三个时间点分泌呈持续上升趋势，在第 6 天 时达 7.714±2.651pg/ml,而在 KPP 组和 KP 组中，IL-10 呈相对强势分泌，KP 组 显著高于 KPP 组（P＜0.01），在第 4 天达峰值随后降低，但 KPP 组仍呈上升趋 势。对照组中未能检测到 IL-10 的表达。在三个实验组中，转化生长因子-β1（TGF- β1）的含量呈持续上升趋势，至第 6 天时仍在升高，且在任一同时间