滤泡辅助性T细胞在口蹄疫重组腺病毒疫苗免疫应答中的作用研究-病原微生物专业毕业论文.docxVIP

宁夏医科大学学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明 引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品 成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名＿＿＿＿＿ 论文导师签名＿＿＿＿＿ 年 月 日 年 月 日 宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明 宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有 关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁 夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公 布（包括刊登）论文的全部或部分内容。 （保密论文在解密后应遵守此规定） 论文作者签名＿＿＿＿＿ 论文导师签名＿＿＿＿＿ 年 月 日 年 月 日 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 中文摘要 I I 滤泡辅助性 T 细胞在口蹄疫重组腺病毒 疫苗免疫应答中的作用研究 摘 要 目的：滤泡辅助性 T 细胞(Follicular T Helper cells，Tfh 细胞)是一类全新的 T 细胞 亚群，Tfh 细胞在 B 细胞的发育、生发中心的形成、抗体类别转换，建立长期体液免 疫应答等过程中扮演主要角色。本研究利用表达口蹄疫病毒 VP1 基因的重组腺病毒疫苗 (rAd5VP1)免疫小鼠，通过观察小鼠脾脏中滤泡辅助性 T 细胞(T follicular helper cells， Tfh)的分化、生发中心（GC）的形成、Tfh 细胞转录因子 BCL-6 mRNA 的表示水平及 Tfh 细胞主要细胞因子白细胞介素-21(interleukin-21，IL-21)的分泌水平，探讨 Tfh 细胞 在口蹄疫重组腺病毒疫苗免疫应答中所发挥的作用。 方法：6 周龄 BALB/c 小鼠，随机分为两组，每组 10 只。实验组免疫 rAd5VP1，对 照组注射 PBS。 1. 免疫后 7d，取小鼠脾脏，分离单个核细胞，通过流式细胞术(FCM)检测 Tfh 细胞 （CD4+CXCR5+PD-1+）的分化、生发中心 B 细胞（B220+GL-7+）的分化；分析 CXCR5+T 细胞/ CD4+T 细胞的比例、CXCR5+ PD-1+T 细胞 / CD4+T 细胞的比例、GL-7+B 细胞 / B220+B 细胞的比例。 2. 免疫后 7d，取小鼠脾脏，分离单个核细胞，通过 real-time RT-PCR 技术检测 Tfh 细胞转录因子 BCL-6 mRNA 的表达水平。 3. 免疫后 7d，取小鼠脾脏，常规方法制作石蜡切片，经 FITC-花生凝集素（Peanut Agglutinin, PNA）染色，免疫荧光显微镜观察生发中心的形成。 4. 免疫后 7d，分离血清，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒检测小鼠血清 中 Tfh 细胞分泌细胞因子 IL-21 的表达水平。 结果： 1. 重组腺病毒疫苗 rAd5VP1 免疫小鼠，7d 后，流式细胞术检测结果显示，重组腺病毒 疫苗 rAd5VP1 能诱导小鼠 Tfh 细胞的分化，而且，单个核细胞中 CXCR5+ T 细胞/ CD4+ II II T 细胞的比例(4.05±0.10)明显高于 PBS 对照组（2.14±0.29），P=0.007. **P 0.01；单 个核细胞中 CXCR5+ PD-1+ T 细胞/ CD4+ T 细胞的比例(1.17±0.17)明显高于 PBS 对照组 (0.69±0.17)，P=0.03.*P 0.05； 2. 重组腺病毒疫苗 rAd5VP1 免疫小鼠，7d 后，流式细胞术检测结果显示，单个核细胞 中 GL-7+B 细胞/B220+B 细胞的比例(3.66±0.53)明显高于 PBS 对照组(1.74±0.05)， P=0.02.*P 0.05; 3. 重组腺病毒疫苗 rAd5VP1 免疫小鼠， 7d 后，real-time RT-PCR 检测 BCL-6 mRNA 的 相对表达水平得到 CT 值，进行相对定量处理得到 2–ΔΔCT 值，再行统计分析得到疫苗 rAd5VP1 免疫组中 BCL-6 mRNA 表达量是对照组表达量的 2.39 倍。P=0.001.**P 0.01。 4. 重组腺病毒疫苗 rAd5VP1 免疫小鼠，7d 后，分离血清，ELISA 试剂盒检测血清中 IL-21 分泌水平，结果显示，rAd5VP1 实验组中 IL-21 表达量（63.68±13.15，pg/ml）明显高 于 PBS 对照组表达量(4