绵果荠、卷果涩荠CBF基因的克隆及分析-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大 学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新 疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文 档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论 文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 I I PAGE PAGE IV 绵果荠、卷果涩荠 CBF 基因的克隆及分析 摘 要 低温逆境胁迫是限制植物生长发育的重要因子。当植物处于低温逆境胁迫时，一系列与抗逆相 关的基因被诱导表达，而 CBF（C-repeat binding factor）基因编码的转录因子就可以激活这一系列 与抗逆相关的功能基因的表达。早春短命植物是一类在春季或夏初短时间里迅速完成生活周期的特 殊生态类型的草本植物。早春短命植物在低温条件下可正常萌发生长，其必定具备高效的抗冷机制。 本研究以绵果荠[Lachnoloma lehmannii Bunge]、卷果涩荠[Malcolmia scorpioides (Bunge) Boiss]和粗果 庭荠[Alyssum dasycarpum Steph. ex Willd]三种早春短命植物为材料，对它们开展了抗冷性评价，并进 行了绵果荠和卷果涩荠抗冷相关的 CBF 基因克隆，生物信息学分析、表达量分析及其原核表达载体 构建等研究，为进一步研究 CBF 基因功能奠定基础，并为深入研究早春短命植物抗寒分子机理提供 理论指导。 1、4℃条件下对三种早春短命植物进行不同时间的低温处理，测定其 7 项生理生化指标，综合 评价三种植物的抗冷能力。结果表明，三种植物的抗冷能力从大到小依次为：卷果涩荠＞绵果荠＞ 粗果庭荠；单一生理生化指标很难反映植物抗冷能力，相对电导率、游离脯氨酸含量、可溶性糖含 量、SOD 酶活性及 POD 酶活性能较好反映各材料的抗冷性大小，可作为早春短命植物抗冷性鉴定 的综合参考指标。 2、通过同源克隆策略和 RT-PCR 技术，克隆了绵果荠和卷果涩荠的 CBF 基因，并设计全长引 物对其进行验证。测序结果表明已成功获得绵果荠、卷果涩荠的 CBF 基因，通过对拼接得到的 cDNA 和验证所得的 DNA 进行比较，发现 CBF 基因不含有内含子。将克隆所得基因序列提交到 GenBank 数据库，获得基因登录号，绵果荠 CBF 基因登录号为 JQ687132，卷果涩荠 CBF 基因登录号为 JQ687138。 3、用生物信息学方法分析、预测绵果荠 CBF、卷果涩荠 CBF 基因的结构及功能特点。绵果荠 和卷果涩荠 CBF 基因及其编码蛋白都具有 CBF 基因家族成员共有的特征，初步判断克隆所得的绵 果荠和卷果涩荠 CBF 基因具有与其他植物 CBF 基因相似的功能，将绵果荠的 CBF 基因命名为 LlCBF 基因，卷果涩荠的 CBF 基因命名为 MsCBF 基因。 4、使用荧光定量 RT-PCR 技术，以 Actin 基因为内参对 LlCBF 基因、MsCBF 基因的低温诱导 表达量进行分析。结果表明，当胁迫 2 h 时，MsCBF 的表达量达到最大，与对照相比提高了近 10 倍。在低温胁迫 6 h 时，根、茎、叶中的 LlCBF 基因表达量均达到最大值。在 24 h 时，LlCBF、MsCBF 表达量均下降到与对照相近的水平。说明这两个基因的表达受到低温胁迫的诱导，并且基因的表达 与绵果荠和卷果涩荠的抗冷具有一定联系。 5、设计加酶切位点的卷果涩荠 MsCBF 表达引物，扩增两端有双酶切位点的 MsCBF ORF 全长， 利用 DNA 重组技术，将该片段插入原核表达载体 pET-28a，成功构建了 CBF 基因的原核表达载体 pET-28a-MsCBF。 关键词：低温胁迫；绵果荠；卷果涩荠；粗果庭荠；CBF 基因；生物信息学分析；基因表达 Cloning and Analysis of CBF Gene from Lachnoloma lehmannii and Malcolmia scorpioides Abstract Low temperature adversit