空肠弯曲菌鞭毛输出系统关键基因flhA突变株的构建及其功能的初步研究-微生物学专业毕业论文.docxVIP

摘要 \ \\\\\\\\\\\\川wmmMmw 摘要 \ Y18519?O 空肠弯曲菌 (Campylobacterjejuni) 为微需氧、无芽炮的革兰氏阴性弯曲短杆菌， 是全球范围内人类感染性腹泻常见的食源性病原菌。鞭毛不仅是其运动器官，更是主 要的潜力因子，在 C.jejuni 黠附、定殖、侵入肠上皮细胞以及毒力蛋白分泌外输过程中 起重要作用。鞭毛输出系统是鞭毛合成、装配以及功能表现重要的结构基础，大部分 研究认为鞭毛输出系统与革兰氏阴性细菌的回型毒力蛋白分泌系统在进化上是问源 的，基因组分析以及相关的实验研究初步显示，鞭毛输出系统很可能承担了 c. jejuni 111型毒力蛋白的转运功能，与巳 jejuni 鞭毛致病性密切布关。 为了深入探索鞭毛输出系统与鞭毛合成以及致病性关联的分子机制，本课题运用 分子生物学手段构建了c.}吃 ;uni 鞭毛输出系统关键基因 flhA 突变株 (HXWOOl) ，并初 步研究了flhA 在毒力和分子调控方面的功能。 1、flhA 插入失活突变株 HXWOOl 的构建与鉴定 本研究使用插入失活的方法构建空肠弯曲菌 flhA 突变株，首先在 E.coil JMI09 中构 建敲除载体 pMD19-飞斤hA-kanr 。其次，使用电转化的方法将其导入到空肠弯曲商中，利 用问源建组获得突变株 HXWOOlo 2、突变株致病相关表型的初步研究 主要包括生长性能、运动能力、菌体结构、自身凝集性 (Autoagglutination) 、菌膜 形成能力等，初步解析c. j吃;uniflhA 与毒力的相关性。结果表明 ，flhA 的缺失，对商体 的生长性能并无明显影响，但是 HXWOOl 菌株的鞭毛缺失且丧失运动能力，生物膜形 成能力和自身凝集现象明显下降，说明 flhA 是鞭毛结构和致病性重要的分子基础。 3、flhA 对鞭毛合成调节功能的初步研究 通过荧光定量 PCR 的方法研究了 flhA 对主要鞭毛丝蛋白基因卢M 、调节基因fliA ( 0 28 ) 和巾。N ( 0 54 ) 在转录水平上的调节功能，结果显示 ，flhA 的缺失降低了鞭毛 结构基因flaA 和鞭毛合成第三级调节基因 fliA 的转录，对鞭毛合成第二级调节基因 rpoN 并无明显的影响，表明 flhA 不仅与鞭毛蛋白输出有关，而且对鞭毛丝蛋白及其调节因 子具有转录水平的调控能力。 4、flhA 与III型毒力蛋白胞内表达和胞外分泌相关性初步研究 首先通过荧光定最 PCR 的方法研究了flhA 对皿型毒力蛋白基因 ciaB 在胞内转录水 平的影响，结果表明 ，jl hA 并不影响111型潜力蛋白基因 ciaB 的胞内转录水平。其次研 究了flhA 对皿型毒力蛋白胞外分泌能力的影响，构建 ciaB 原核表达系统，并且制备和 纯化了 CiaB蛋白，用于制备 Ci榻的多克降抗体，便于今后运用 Westem blot 的方法定 性观察jl hA 突变株以WOOl 与野生型在 CiaB蛋白分泌能力上的差异程度。 关键词:空肠弯曲商 ，flhA， 鞭毛，基因调节 11 11 Abstract Abstract Campylobacter jejuni ，a microaerophilic ，制porous，Gram.negative bacterium ，is 由emost 仕equently gastrointestinal food-bome pa由ogen worldwide 川agellum can not only provid motility to 伽.e cel1，but also is an important virulence 如ctor，which plays an important role in adhesion，colonization， and the secretory of invasion protein of C.jejuni. Flagellar export appara阳s is a very important structure of flagellar synthesis ，assembly and work.A lot of researches consider 由at the flagellar export app即atus is homologous wi伽也e type III secretion systerm of the gram-negative bacterium in evolution.Genome analysis had i