抗黄曲霉素B1荧光重组抗体的制备-营养与食品卫生学专业毕业论文.docxVIP

摘要 抗黄曲霉毒素 Bt 荧光重组抗体的制备 摘要  11111111111111111111111111111111111111111111111111 Y1851550 黄曲霉毒素 (Aspergillus flavus toxin) 是一类结构类似的化合物，其中以黄曲霉毒 素 B) (AFB)) 毒性最强。常规检测 AFB ，的方法有生物学方法、HPLC 及薄层层析等方 法:由于各方法的周限性，人们逐渐专注于应用免疫学方法进行检测。由于免疫学方法 检测中需要使用酶，而酶本身的性质不稳定，容易出现假阳性或假阴性结果。为克服 AFB ，免疫学检测结果的不稳定性，本论文将银色荧光蛋白质与抗AFBl 单链抗体进行了 融合表达，通过检测融合蛋白的荧光强度得到稳定的检测结果，为实现使用免疫学方法 对 AFB ，稳定町靠的检测奠定良好基础。 绿色荧光蛋白质(Gr een fluorescent prote烛， GFP) 最初是从维多利亚水母中分离得 到，由于其荧光稳定、无毒害、易于构建载体等优点常作为报告基因，应用于基因表达 及蛋白质定位。抗 AFB ，单链抗体(Single Chain Fra伊lent Variable ，ScFv) 是由本研究室 前期筛选获得，在以上 ScFv 及 GFP 基础上，本研究探索构建了 8 种不同的重组质粒， 同时在大肠杆菌中进行了表达，经过筛选最终获得了既具有抗体活性又有荧光活性的双 震活性的融合蛋臼质。 本研究首先将筛选得到的抗 AFBl 的 ScFv 基因与 GFP 基因借助于一个 linker 进行 迹接，分别组成 GFP-linker.ScFv 与 ScFv-linker-GFP ，构建了重组质粒pET22bScFv-G陀、 pET22b-GFP-ScFv 、pET32aScFv-GFP 、pE丁32a-GFP-ScFv 0 将构建成功的宽组质粒转化 入表达宿.ì:大肠杆菌 E.co/i BL21ρE拟中进行原核表达，经 Ni-柱纯化眉得到目标蛋白 质，而后对融合蛋白的活性分别进行酶联免疫法 (ELISA) 检测与荧光显微镜检测。结 果表明 BL21 仰IE3) /pET22bScFv-GFP 与 BL21(DE3) /pET32a-ScFv-GFP 的表达产物抗体 效价分别为 0.930 与 0.918 ，但二者均无荧光活性。而BL21ρIE3) /pET22b-GFP-ScFv 、 BL21ρE3) /pET32a-GFP-ScFv 的表达产物正好相反，即有荧光但无抗体活性。全细胞变 性蛋白电泳结果表明，这四种意组蛋白在宿主商内表达后可能发生了降解。 本课题组前期研究证实了 ScFv 的重链可变区 VH 具有识别抗服的能力，在此基础 上本研究又构建了重组质粒 pET22b-VH-GFP 、pET22b-GFP VH 、pET32a-VH-GFP 、 pET32a-GFP-VHo 将构建成功的重组质粒转化入 E.co/i BL21(DE3) 中表达，经 ELIA 及 荧光显微镜检测表明 ，BL21(DE3) /pET22b-VH-GFP 产物的效价为 0.915 ，但产物无荧光: BL21ρIE3)/pET22b-GFP- VH 的表达产物具布较强的荧光，效价仅为 0.223 0 pET32aVH-G陀、 pET32aGFPVH 能够在 E.coli BL2 (DE3) 中表达较好的双重活性， 抗体效价分别为 0.920 句 0.506 ，纯化后的融合蛋白在波长488mn 下激发，在 495mn 处 发射出强度分别为 1554、661.5 的荧光，二者的表达量分别为 145μ gIL、 131μ gIL。 综上，本研究表明重组菌株 BL21(DE3)(DE3)/pET32a-VH GFP与意组菌株BL21 (DE3) /pET32船GFP-VH所表达的融合蛋白具有较好的抗原识别能力和荧光活性。者将所表达 的融合蛋白质与抗原特异性结合，可以直接通过融合抗体所发射出的荧光初步定性地判 11 11 摘要 断被检测物质是否含有 AFBI ，在此检测过程中不需要酶的参与，即克服了免疫学方法检 测IAFBI中出现假阳性或假阴性的现象，在定性检测的同时还吁以借助专门的仪器如流式 细胞仪对其进行定量分析，最终为融合抗体应用于食品中 AFB 1的直接快速检测奠定良好 的基础。 关键词:黄曲霉毒素 Bn 单链抗体: 绿色荧光蛋白质;融合表达:酶联免疫 Abstract Abstract Af1atOxin (Aspergillus flavus toxin) are cOmpOunds with a sìmil