抗菌肽CM4在昆虫细胞sf9中的表达及其中和内毒素机理研究-生物学；生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

抗菌肽 抗菌肽 CM4 在昆虫细胞 Sf9 中的表达及其中和内毒素机理的研究 I I 摘要 抗菌肽是动植物体内分泌的一类小分子活性多肽，一般由15-45个氨基酸组 成，在动植物的免疫系统中发挥着重要作用。目前，由于抗生素的滥用导致耐药 菌株不断增多，人们对抗菌肽的研究投入极大热情。 家蚕抗菌肽 CM4 由张双全等人从中国家蚕中诱导获得的，属于 Cecropin 家族中的一个成员,为线性、α-螺旋肽，含有 35 个氨基酸；抗菌肽 CM4 具两亲 性：N 端具有亲水性、C 端具有疏水性，同时抗细菌、抗真菌及抗肿瘤作用，且 对正常真核细胞无明显毒副作用。 第一部分 抗菌肽 CM4 在昆虫细胞 sf9 中的表达 我们参照 CM4 序列合成了昆虫细胞偏爱密码子的引物，经 rPCR 获 CM4 基 因，加 HIS 标签及酶切位点后重组到复制载体 pFastBacHTB 上，再将此重组质粒 pFastBacHTB-CM4 转化 DH10Bac 大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性菌落，抽提大分 子质粒 DNA，获得含 CM4 基因的重组杆状病毒穿梭载体 Bacmid-CM4,脂质体介导 转染 Sf9 昆虫细胞，获高滴度病毒表达。经 Tricine-SDS 凝胶电泳和 Western blotting 检测，结果表明插入的目的基因在昆虫细胞中获得融合表达。本实验 建立的昆虫/杆状病毒表达系统为 CM4 的大量获得提供一条新途径，为进一步的 抗菌机理的研究及新药的开发打下工作基础。 第二部分 抗菌肽 CM4 的中和内毒素机理研究 我们首先在体外研究抗菌肽 CM4 与 LPS 的结合效率，用鲎实验(LAL assay)检 测发现抗菌肽 CM4 能与 LPS 高度结合，并用 MTT 法检测 CM4 对细胞无毒性。进一 步，在小鼠巨噬细胞 Raw264.7 中研究 CM4 对 LPS 诱导炎症反应的影响，利用 RT-PCR 和 ELISA 试剂盒检测发现 CM4 能在 mRNA 水平上和蛋白水平上显著抑制 LPS 刺激细胞诱导产生的主要细胞因子 TNF-a 和 NO 的量。以上数据表明 CM4 具有 中和内毒素的性质， 可作为抗炎新型药物候选成员，为炎症治疗提供一个新的 视角。 关键词：抗菌肽CM4，表达，昆虫细胞Sf9，脂多糖，中和 II II Abstract Antibacterial peptide is a kind of small molecular polypeptide which consists of 15-45 amino acids and is a key component of the ancient innate immune system secreted by animals and plants. At present, with more and more drug resistant microorganisms emerging on account of antibiotic abusee, people take a great passion on antibacterial peptide research. Antibacterial peptide CM4 isolated from Chinese Bombyx mori by Zhang et al. , belongs to a member of the cecropin family. CM4 is a small linear α-helics peptide that consists of 35 amino acids. CM4 may be amphipathic, with the N-terminal being positively charged and the C-terminal being hydrophobic. Meanwhile, it could kill bacteria, tumors and fungi by permeabilizing the cell membranes without being toxic to mammalian cells. We synthesized primers of insect cell preferred codons according to CM4 gene. After recursive PCR (rPCR), his tags and enterokinase cutting sites adding in CM4, we cloned CM4 gene into the baculovirus expression vector pFastBac