慢病毒介导的CARMA1稳定沉默对K562细胞侵袭转移能力的影响-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

PAGE PAGE 3 慢病毒介导的CARMA1稳定沉默对K562细胞侵袭转移能力的影响 中文摘要 【目的】慢性粒细胞性白血病，简称慢粒（chr oni c myel ocyt i c l eukemi a, CML） 是一种起源于骨髓多能造血干细胞的获得性恶性增殖性疾病。90%以上的病例均 具有 CML 的标记染色体 费城染色体，其分子生物学基础则是 BCR- ABL 基因重 排。BCR- ABL 可引起 NF- κB 的活化，引起肿瘤生长、转移、耐药等肿瘤生物学 特性的改变。CARMA1 高表达于慢粒，可能在 BCR- ABL 诱发的 NF- κB 活化中起重 要作用。EGR- 1 为一抑癌基因，其启动子序列中含有 NF- κB 的连接位点，可共 同调控肿瘤的侵袭转移。本研究通过分析慢病毒介导的 CARMA1 的稳定沉默引发 的 K562 细胞侵袭转移能力及相关信号通路的改变，探讨可能机制。 【方法】应用慢病毒质粒系统和包装细胞 293T，利用磷酸钙共沉淀转染法包装 合成能使 CARMA1 基因表达稳定沉默的慢病毒颗粒并用其感染 K562 细胞， pur omyci n 选择性筛选，构建 CARMA1 基因稳定沉默的细胞株模型。利用 RT- PCR 检测 CARMA1 mRNA 表达，West er n Bl ot 检测 CARMA1 蛋白表达，台盼蓝拒染法检 测细胞生长情况，克隆形成实验检测细胞克隆形成情况。体外迁移和侵袭实验 （Tr answel l 小室共培养系统和 Mat r i gel 胶）等分析 CARMA1 抑制对肿瘤侵袭转 移能力的影响及其引起的相关信号通路分子的改变，深入探讨可能机制。 【结果】K562 经携带 shRNA 的慢病毒颗粒感染，pur omyci n 筛选后成功构建六株 细胞株：其中一株为阴性对照（K562/ sh- eGFP），另五株为实验组（K562/ shCARMA 1- 90、K562/ shCARMA 1- 91、K562/ shCARMA 1- 92、K562/ shCARMA1- 93、K562/ shCARMA 1- 94）。经 RT- PCR、West er n Bl ot 鉴定后，发现 K562/ shCARMA 1- 93 对 CARMA1 的抑制效果最好。利用该细胞模型进行后续研究，得出以下结果：（1）台盼蓝拒 染法表明，K562/ shCARMA 1- 93 的生长受到明显抑制（P0. 01）。培养一周后， 相比空白对照 K562 和阴性对照 K562/ sh- eGFP，生长抑制率分别为 29. 3%和 28. 6% ；在克隆形成实验中也发现 K562/ shCARMA 1- 93 克隆形成能力下降 （P0. 01）。相比空白对照 K562 和阴性对照 K562/ sh- eGFP，克隆抑制率分别达 37. 6%和 34. 1%。体外迁移和侵袭转移实验证实，K562 和 K562/ sh- eGFP 穿膜细胞 数没有明显差异（P＞0. 05）。K562/ shCARMA1- 93 穿膜细胞数与对照组相比，差 异有显著性意义（P0. 01）。说明抑制 CARMA1 能显著降低 K562 细胞侵袭和迁移 能力。（2）应用 WB 和 RT- PCR 技术检测信号通路分子的改变，结果发现 CARMA1 抑制后，BCL10、NF- κB 及 EGR1 的表达随之下降。 【结论】应用慢病毒介导的 RNAi 技术成功构建 CARMA1 稳定沉默的细胞模型 K562/ shCARMA1- 93。利用该细胞株发现 CARMA1 的抑制会导致 BCL10、NF- κB 和 EGR1 受到不同程度抑制，影响 K562 细胞的生长及克隆形成，降低其迁移和侵袭 能力。 【关键词】CARMA1 CML RNA 干扰 慢病毒 迁移 侵袭 The eff ect s of St abl e si l ence of CARMA1 by l ent i vi r us on K562 cel l ’s i nvasi on and met ast asi s ABSTRACT Obj ect i ve: Chr oni c myel ognous l eukemi a（CML） was a mal i gnant di sease of pr ol i f er at i on whi ch or i gi nat ed f r om t he bone marr ow mul t i pot ent hemat opoi et i c st em c