课件：蛋白质和氨基酸测定学时概述.ppt

C、测定 C8或C18柱 流动相：柠檬酸、辛烷磺酸钠、乙腈组成 流速1mL/min，柱温40℃，进样量20μL 波长240nm 。 * 二、分光光度法 方法 原理 紫外吸收法 蛋白质在280nm处有吸收。 考马斯亮蓝比色法 考马斯亮蓝使蛋白质染色，在620nm处有最大吸收（标准物质：牛血清蛋白bovine serum albumin）。 双缩脲法 双缩脲与碱性铜生成紫红色配合物，在560nm处有最大吸收。（备注1） lowry法 蛋白质-铜络合物中的酪氨酸及色氨酸残基使磷钼酸-磷钨酸（Folin phenol reagent）还原成蓝色物质。（备注2） * 备注1： * 双缩脲法 备注2： （1）lowry法的原理 色泽的变化主要缘于钼、钨化学价的降低，该物质的吸收波长在550-750nm之间，当蛋白质浓度在1-100μg/ml时，用750nm或660nm，当蛋白质含量更高时，用550nm。 没有铜离子时，色泽由蛋白质中的酪氨酸及色氨酸残基含量决定，其次是半胱氨酸和组氨酸残基含量决定，铜离子将肽键聚合在一起，从而加速了电子的传递。 干扰物质较多：柠檬酸，tris，甘氨酸，组氨酸，谷氨酸，EDTA，葡萄糖，果糖，高浓度的尿素，硫酸铵等都有影响。 * （2）试剂组成（/hanse