教案大肠杆菌基因组DNA的提取与电泳鉴定-长沙医学院.DOCVIP

教 案 2012 ~ 2013 学年第 1 学期 课 程 名 称 生物化学实验 开 课 系 部 基础医学系 开 课 教 研 室 生物技术 授 课 教 师 赵娟 职 称 助教 授 课 班 级 生物技术 学 生 人 数 长 沙 医 学 院 教 务 处 制 长 沙 医 学 院 教 案 课程名称 生物化学实验 授课题目（章节或主题） 大肠杆菌基因组DNA的提取与电泳鉴定 授课教师 赵娟 所属系（部） 基础医学系 所属教研室 生物技术 职称 助教 授课时间 2012 年 11 月 15日第13周星期4 第 6- 授课时数 5学时 授课班级 生物技术 专业（本科 eq \o\ac(□,√) 专科□） 2010 级 1 班 教学课型 理论课□ 实验课 eq \o\ac(□,√) 见习课□ 习题课□ 讨论课□ 其它□ 教材名称、作者、出版社及出版时间 《基础生物化学实验》，高等教育出版社，魏群，2009 教学目的要求： 1. 掌握DNA提取的原理和方法； 2. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法 重点与难点： 重点：大肠杆菌基因组DNA快速提取的原理；大肠杆菌基因组DNA快速提取的方法；琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法 难点：大肠杆菌基因组DNA快速提取的原理；琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法 教学方法（请打√选择）： 讲授法□ 讨论法□ 启发式□ 自学辅导法□ 练习法(习题或操作) eq \o\ac(□,√) 读书指导法□ ＰＢＬ（以问题为中心的教学法）□ 其他□ 教学手段（请打√选择）： 板书 eq \o\ac(□,√) 实物□ 标本□ 挂图□ 模型□ 投影□ 幻灯 eq \o\ac(□,√) 录像□ CAI（计算机辅助教学）□ 教学过程设计和教学内容：多媒体教学，讲授法、启发式提问法 教学内容： 大肠杆菌基因组DNA的提取 原理 本实验利用溶菌酶和碱裂解液SDS使细胞壁破坏，利用氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液利用乙醇将DNA沉淀下来。 材料、试剂、仪器 实验菌株：大肠杆菌 试剂：TE溶液：Tris?HCl 10 mM，EDTA 1 mM 20% SDS： 溶菌酶（50mg/ml） 5M NaCl 氯仿：异戊醇（24：1 v/v） 无水乙醇 0.8%琼脂糖 TAE电泳缓冲液 仪器：离心机，电泳仪 实验步骤： 取1.5ml培养好的大肠杆菌培养液与离心管中，7,000 rpm离心5 min，弃上清； 加入500ul TE溶液洗涤菌体7,000 rpm离心5 min，弃上清； 用360ul TE溶液悬浮菌体，加入20ul 溶菌酶（50mg/ml），37°C 加入40ul 20 %SDS使其终浓度为2 %，60°C水浴30min。 加入110ul 5 M 高氯酸钠 使其终浓度为1 M，充分混匀； 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1 v/v），充分混匀，4°C 12,000 rpm 离心15min，吸取上清于一新离心管中； 加入2倍体积的无水乙醇，混匀后12000rpm 离心10min； 弃上清，离心管在空气中自然晾干； 加入30-40ul TE溶解DNA； 取3-5ul DNA溶液，琼脂糖电泳检测。 琼脂糖电泳检测 原理 由于DNA结构的重复性，核苷酸数相同的DNA几乎具有等量的净电荷，所以核酸携带的电荷的差异几乎不造成对核酸迁移率的差异，而真正决定DNA分子在某一特定电场下的电泳迁移率因素取决于DNA分子的大小、构象、构型。采用适当浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使大小、构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，以达到分离的目的。 材料、试剂和仪器 细菌基因组DNA 琼脂糖、6×Loading Buffer、DNA分子量marker、溴化乙啶（EB） 3. 仪器：琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统 实验步骤 凝胶的制备 配0.7%的胶：称取0.21g的琼脂糖，置于三角瓶中，加入1×TAE 30ml，盖上铝箔纸，放在微波炉中化胶，注意用中低火（约1～2分钟），避免沸腾和溢出。 轻旋转三角