罗汉松实醇提物对人胃癌细胞的抑制作用研究-中药学专业毕业论文.docxVIP

目 录 中文摘要Ⅰ 英文摘要Ⅲ 缩略词表Ⅶ 前 言1 正 文4 1.罗汉松实醇提物的制备4 2.MTT 法对罗汉松实醇提物进行生物活性部位的筛选 5 3.MTT 法确定罗汉松实醇提物生物活性部位的最佳给药浓度 9 4.流式细胞术 AnnexinVFITC-PI 法检测罗汉松实醇提物生物活性部位对 MGC-803 细胞凋亡的影响 11 5.罗汉松实醇提物生物活性部位抗肿瘤作用机制的研究15 结语25 参考文献26 文献综述29 附录45 致谢46 I I 中文摘要 目的：本文旨在通过药物体外实验，初步筛选出对肿瘤细胞 MGC-803 有抑 制作用的罗汉松实提取部位，并联合流式细胞术以及实时荧光定量 PCR 技术对罗汉松实提取物抗肿瘤作用的机制进行初步探讨。 胃癌，是常见的消化道恶性肿瘤，在我国有着较高的发生率和死亡率， 已成为严重危害人们身体健康的疾病。据报道，每年约有六十四万人因胃 癌而死亡。目前，胃癌的治疗手段以手术治疗为主，再加以化学疗法、放 射疗法、分子靶向治疗等辅助疗法。值得一提的是，中医药作为我国的文 化瑰宝，具有较小的毒副作用，能在缓解患者因疾病或放化疗而产生痛苦 的同时提高其术后生存率，在胃癌的治疗方面起着重要的作用。 罗汉松科植物罗汉松 Podocarpus macrophyllus (Thunb．)D．Don， 又名罗汉杉、长青罗汉杉、土杉、金钱松、仙柏、罗汉柏、江南柏，为常 绿乔木。由于罗汉松种托大于种子，成熟时呈红色，加上绿色的种子，形 似罗汉，故名罗汉松。罗汉松种子及其种托合称为罗汉松实。研究表明[1-2]， 罗汉松属植物所含的双黄酮、芹菜素等成分对胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢 癌等各种癌症均有一定的防治作用，由于未见罗汉松实提取物体外抗肿瘤 方面的研究，故本实验以人胃癌细胞 MGC-803 为研究对象，初步探讨罗汉 松实提取物对肿瘤细胞的生长抑制作用，为进一步研究其抗肿瘤机制提供 理论依据。 方法：1. 罗汉松实醇提物的制备：人工将罗汉松种子及其种托分离，粉 碎后分别用水，95%，75%，50%乙醇对其进行提取，将得到的不同浓度乙 醇部位罗汉松实提取物进行冷冻干燥，备用。 2. 罗汉松实醇提物生物活性的筛选：本文以体外培养的人胃癌细胞 MGC-803 为研究对象，选用噻唑蓝（MTT）法测定罗汉松实提取物对 MGC-803 细胞的增值抑制率，将半数致死率作为评定指标筛选出罗汉松实提取物的 活性部位。 3. 确定最佳给药浓度：将筛选出的罗汉松实醇提物的生物活性部位配置 II II 成不同浓度梯度的溶液，通过 MTT 实验，寻找活性部位的最佳给药浓度。 4. 运用流式细胞术研究罗汉松实提取物活性部位对 MGC-803 细胞的细胞 周期影响。 5. 运用实时荧光定量 PCR 技术研究罗汉松实醇提物活性部位作用于人胃 癌细胞 MGC-803 后，肿瘤细胞中的凋亡相关基因 BcL-2、P53、C-myc 以及 Bax 的相对表达情况。 结果：1. MTT 筛选实验结果显示，对人胃癌细胞 MGC-803 有生长抑制作 用的是罗汉松种子提取物，其中的活性部位为 95%乙醇提取物，当该部位 溶液浓度为 50μg/ml 时，作用 MGC-803 细胞 48 小时后，对人胃癌细胞的 抑制率达到 68.38%，且其作用强度与作用时间呈正相关关系。 2. 流 式 细 胞 仪 检 测 人 胃 癌 细 胞 MGC-803 的 凋 亡 率 实 验 结 果 表 明 ， MGC-803 细胞的凋亡率与罗汉松种子提取物 95%乙醇部位的给药浓度呈正 相关关系，随着给药浓度的增加，细胞凋亡率也随之增大。 3. 实时荧光定量 PCR 结果表明，与对照组相比，不同质量浓度罗汉松种 子提取物 95%乙醇部位作用于 MGC-803 细胞，显著性下调细胞凋亡相关基 因 Bcl-2 和 C-myc，上调 P53 和 Bax。 结论：罗汉松种子醇提物在体外对人胃癌细胞 MGC-803 均有明显的增值抑 制作用，其中的生物活性部位为罗汉松种子 95%的乙醇提取部位，且随着 提取物浓度的增加和作用时间的延长，其对胃癌细胞的抑制率呈上升趋 势，这可能与其能调控相关凋亡基因的表达有关。 关键词：罗汉松实醇提物；MTT；MGC-803 细胞；凋亡相关基因 PAGE PAGE VI The Inhibitory Effects of Podocarpus Seeds and its Tray Extract on Human Gastric Cancer Cells Speciality: Traditional Chinese Medicine Author: Zhou Yan Supervisor: Prof . Liu HeGang ABSTRACT Ob