链霉菌噬菌体ФC31位点特异性整合酶的结构与功能初步探讨-医学遗传学专业毕业论文.docxVIP

复旦大学硕士学位论文 复旦大学硕士学位论文 链霉菌噬菌体0C31位点特异性整合酶结构与功能的初步探讨 摘要 ①C31位点特异性整合酶由于能介导携带有attB序列的目的基因位点特异 性整合到哺乳动物细胞基因组中，因而该系统已成为基因操作及基因治疗的强有 力工具。然而，该整合酶在哺乳动物细胞上介导整合的位点特异性和整合效率仍 需进一步提高。而解析0C31位点特异性整合酶结构与功能关系是解决上述问题 的基础和关键。为此，本研究利用生物信息学对0C31位点特异性整合酶结构进 行预测，结合分子生物学技术对其结构与功能关系进行初步探讨，其结果如下： 1、利用生物信息学对包含oC31位点特异性整合酶在内的丝氨酸位点特异 性重组酶家族30个成员进行同源比对，结果显示：aal一120为催化结构域，其 在整个家族里是保守的；aa291-359含有许多带电残基(22aa)和极性残基(10aa)， 预测为蛋白多聚化相关区域，4个保守的Cys残基位于aa353--405，该区域可能 是DNA结合相关区域，aa416--504为Leu富含区，包含了14个Leu，aa457--527 预测为Q螺旋结构。 2、依据0C31位点特异性整合酶结构预测构建了pEl22b-OC3h一522等八个 截断突变体质粒。这些质粒分别与OC31报告质粒共转在体内进行整合活性检 测。结果显示所有的截断突变体均表现为蓝斑，而对照野生型表现为白斑，提示 所有截断突变体已丢失重组活性。 3、截断突变体质粒pET22b一0C31,一528等转化Rossetta菌经诱导表达及镍柱 纯化，结果显示八个蛋白分子量由大到小分别为54KD、49KD、43KD、37KD、31KD、 16KD、37KD、16KD，其中六个蛋白的纯度达到90％以上。上述蛋白经Western blot 检测，显示的条带与预期大小一致。 4、截断突变体DNA结合能力检测。利用凝胶迁移滞后实验技术分别检测八 个截断突变体的DNA结合能力，结果显示：0C311—528：0C311-472：0C3h-413和① C31279-七13可见相应的结合条带，提示其具有DNA结合能力，而0C311．383：oC31,-279； 0C311—120；oC31s53-472观察不到相应的结合条带，提示其已经丧失了DNA结合能 力。 总之，本研究在生物信息学结构预测的基础上，利用生物学技术和方法通过 对0C31截断突变研究，率先证实了aa353—413与其DNA结合能力相关，发现了 即使缺失C末端aa528—613也影响其重组活性。这一发现对于进一步了解oC31 位点特异性整合酶的结构信息，对其结构进化，并为提高其特异性和整合效率奠 定了基础。 关键词：0C31整合酶，位点特异性重组，att位点，结构预测，蛋白表达纯化， 重组活性，DNA结合功能域， 2 复旦大学硕士学位论文 复旦大学硕士学位论文 链霉菌噬菌体中C3 1位点特异性整合酶结构与功能的初步探讨 ABSTRACT The OC3 1 site-specific integrase can promote genomic integration of plasmids carrying attB into native mammalian sequences．Consequently it has become a powerful tool for gene manipulation and gene therapy．However，the specificity and efficiency of integration in mammals need to be further improved．Analysis the relationship between structure and function of the oC3 1 integrase is the basis and key for solving above problems．To this end，this study use bioinformatics to forecast the structure of the少C3 1 site-specific integrase。then combined witll molecular genetics technology to preliminarily study its relationship between structure and function，the results are as follows： 1．The structure prediction of