双向电泳试验试剂及溶液.DOC

双向电泳试验试剂及溶液 所有含尿素溶液加热不能超过30℃ 去离子水或MilliqQ水配制所有溶液。 分析纯试剂，保质期内使用。 推荐使用进口试剂。 A. 双向电泳的样品裂解溶液(含有尿素) （8 M尿素，4% CHAPS，2%两性载体Pharmalyte或IPG缓冲液(载体两性电解质)，40 mM DTT, 10 ml） 最终浓度 用量 尿素(FW 60.06) 8 M 4.8 g CHAPS 4% (w/v) 0.4g 两性载体Pharmalyte 或IPG缓冲液 （现用现加） 2% (v/v) 200 μl DTT (FW 154.2) （现用现加） 40 mM 61.6 mg 去离子水 — 至10 ml (需要水约6.4ml) 1.0ml/支 分装，储存于-20℃条件下。IPG buffer和DTT现用现加。 B. 尿素水化储备溶液 （8 M尿素，2% CHAPS，0.5/2%两性载体Pharmalyte或IPG缓冲液，0.002%溴酚蓝, 10 ml） 最终浓度 用量 尿素(FW 60.06) 8M 4.8g CHAPS 2%(w/v) 0.2g 1%溴酚蓝储备溶液 0.002% 20μl 去离子水 — 至10ml(需要水约6.4ml) 分装为1.0ml溶液储存于-20 ℃条件下。 使用前加入DTT，每1.0ml水化储备溶液中加入2.8mgDTT(FW 154.2，1.8mM)。 使用前加入与IPG胶条的范围相同IPG buffer，终浓度0.5%(v/v)。 C. SDS平衡缓冲液 (6 M尿素，75 mM Tris-HCl pH8.8,29.3%甘油, 2%SDS,0.002%溴酚蓝,100ml) 最终浓度 用量 尿素(FW 60.06) 6 M 36.1 g Tris-HCl, pH 8.8 (参见溶液F部分) 75 mM 5.0 ml 甘油(87% w/w) 29.3% (v/v) 34.5 ml (84.2 g) SDS (FW 288.38) 2% (w/v) 2.0 g 1%溴酚蓝储备溶液 0.002% (w/v) 200 μl 去离子水 — 至100 ml 这是储备溶液。在使用之前，按照一定量加入1%DTT（100mg/10ml）或2.5%碘乙酰胺（250mg/10ml），分别用于第一次和第二次平衡。Max用量 10ml/胶条。 分装20mL/支，储存于-20℃条件下。 D. 10× Laemmli SDS电泳缓冲液 (250 mM Tris碱，1.92M甘氨酸，1% SDS，1.0L) 最终浓度 用量 Tris碱(FW 121.1) 250 mM 30.3 g 甘氨酸(FW 75.07) 1.92 M 144.1 g SDS (FW 288.38) 1% (w/v) 10.0 g 去离子水 — 至1.0L * 不要调节该溶液的pH值。 室温储存。 E. 30% T, 2.6% C单体储液 (30%丙烯酰胺，0.8% N, N’-甲叉双丙烯酰胺，500ml) 最终浓度 用量 丙烯酰胺(FW 71.08) 30% 150 g N,N’-甲叉双丙烯酰胺(FW 154.17) 0.8% 4 g 去离子水 — 至500mL 用0.45μm滤膜过滤溶液，4℃避光储存。 F. 4×分离胶缓冲液 (1.5M Tris碱，pH8.8，200mL) 最终浓度 用量 Tris碱(FW 121.1) 1.5 M 36.3g 去离子水 — 150 ml HClaq — 调至pH8.8 去离子水 — 至200mL 用0.45μm滤膜过滤溶液，4℃存储。 G．溴酚蓝储备溶液 最终浓度 用量 溴酚蓝 1% 100 mg Tris-碱 50 mM 60 mg 去离子水 — 至10 mL H. 10% SDS溶液 (10% SDS, 20 ml) 最终浓度 用量 SDS (FW 288.38) 10% (w/v) 2.0 g 去离子水 — 至20 ml 用0.45μm滤膜过滤溶液，室温存储。 I. 10%过硫酸铵溶液 (10%过硫酸铵, 5 ml) 最终浓度 1 ml用量 1.5ml EP管5支，每支加入过硫酸铵(FW 228.20) 10% (w/v) 0.1 g 去离子水（现用现加） — 至1 ml 新鲜的过硫酸铵在加入水时发出“劈啪”声，若没有声音，请更换过硫酸铵。 J. 琼脂糖密封液 (25mM Tris碱, 192mM甘氨酸, 0.1% SDS, 0.5%琼脂糖, 0.002% 溴酚蓝, 10ml) 最终浓度 用量 10xLaemmli电泳缓冲液（见溶液D） 1 ml 琼脂糖(NA 或M) 0.5% 0.05 g 1%溴酚蓝储备溶液 0.002% (w/v) 20 μl 去离