利用转基因小鼠模型研究FHL3基因对不同肌纤维类型形成的影响-动物遗传育种与繁殖专业毕业论文.docxVIP

利用转基因小鼠模型研究FHL3基因对不同肌纤维类型形成的影响目 利用转基因小鼠模型研究FHL3基因对不同肌纤维类型形成的影响 目 录 摘要 一i Abstract． ． ．． ．． ． ． ． ． ．． ．． ． ．． ． ． ． ． ． ． ． ． ．． ．iii 缩略词表 ．v 第一章文献综述 ．1 1骨骼肌肌纤维的分类、特征及对肉质的影响 ．1 1．1骨骼肌肌纤维的分类 1 1．2骨骼肌肌纤维不同类型的特征 2 1．3骨骼肌不同肌纤维类型对肉质的影响 3 2调控肌纤维类型的信号通路 ．4 2．1胰岛素样生长因子(IGFs)信号通路 5 2．2钙调磷酸酶．活性T细胞核因子(CaN姗AT)信号通路 5 2．3生肌调节因子(MI讧s)途径 ．6 3 FHL3家族的研究进展 7 3．1 LIM蛋白的分类和功能 7 3．2 FHL家族成员及特点 8 3．3 FHL3的功能及其调控机制 ．9 4转基因动物的研究进展及制备方法 lO 5研究的目的和意义 12 第二章材料和方法 13 1试验材料 1 3 1．1试验样品 ．13 1．2主要仪器和设备 ．13 1．3主要试剂与试剂盒 ．1 5 1．4常用试剂及配制 ．16 1．5应用的生物信息学网站及分析软件 ．1 7 1．6所用载体 ．18 2试验方法 l 8 2．1细胞培养 ．18 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文2．1．1细胞的复苏 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 2．1．1细胞的复苏 18 2．1．2 C2C12细胞的增殖培养 19 2．1．3 C2C12细胞的分化培养 19 2．1．4细胞的冻存 19 2．2 FHL3转基因载体构建 19 2．2．1总RNA的提取和cDNA的制备 19 2．2．2小鼠FHL3 cDNA的克隆 21 2．2．3琼脂糖凝胶电泳和成像 22 2．2．4 PCR产物的胶回收和克隆测序 22 2．2．5质粒提取 23 2．2．6 pEGFP-N1L．MCK．FHL3转基因载体的酶切鉴定 ．23 2．3转基因小鼠的饲养 ．．24 2．4鼠尾DNA提取 24 2．5 Quantitative real—time PCR分析 一25 2．6转基因小鼠绝对定量拷贝数检测 一26 2．7转基因小鼠插入位点检测 一27 2．7．1热不对称交错式PCR及引物序列 ．27 2．7．2琼脂糖凝胶电泳和成像 28 2．7．3 PCR产物的胶回收和克隆测序 28 2．7．4外源基因插入位点验证 28 2．7．5琼脂糖凝胶电泳和成像 29 2．8 Western blotting分析 ．29 2．8．1蛋白提取 29 2．8．2 BCA蛋白浓度测定 30 2．8．3 SDS．PAGE电泳 30 2．8．4转膜 一3 1 2．8．5封闭 ．31 2．8．6免疫反应 3 1 2．8．7 ECL化学发光检测 3 l II 万方数据 利用转基因小鼠模型研究FHL3基因对不同肌纤维类型形成的影响2．9转基因小鼠的形态学检测 利用转基因小鼠模型研究FHL3基因对不同肌纤维类型形成的影响 2．9转基因小鼠的形态学检测 ．32 2．9．1转基因小鼠组织样品的采取 一32 2．9．2石蜡切片的制作 ．．32 2．9．3 HE染色 ．32 2．9．4骨骼肌冰冻切片及ATP酶染色 ．33 2．9．5琥珀酸脱氢酶染色 ．．33 第三章研究结果与分析 35 1．构建肌肉特异表达FHL3基因的转基因载体 35 2．转FHL3基因小鼠传代以及PCR检测筛选 ．36 3．转FHL3基因小鼠遗传性能及体重的变化 36 4．转FHL3基因小鼠睾丸组织形态的变化 38 5．外源基因拷贝数检测 ．．39 6．外源基因插入位点的研究 一40 7．转FHL3基因小鼠的组织表达谱 42 8．转FHL3基因小鼠肌肉HE染色 42 9．转FHL3基因小鼠中不同肌纤维类型的变化 43 10．转FHL3基因小鼠不同肌纤维类型的形态学鉴定 46 第四章讨论 47 1．转FHL3基因小鼠的拷贝数、插入位点研究 47 2．转FHL3基因小鼠繁殖性状的研究 48 3．转FHL3基因小鼠肌纤维数目和横截面积的变化 49 4．转FHL3基因小鼠中不同肌纤维类型的变化 49 第五章小结 5 l 1．主要研究结果 ．．5 l 2．下一步工作计划 一5 1 参考文献 52 在读期间发表的文章 67 致谢 ．．68 III 万方数据 利用转基因小鼠模型研究FHL3基因对不同肌纤维类型形成的影响摘要 利用转基因小鼠模型研究FHL3基因对不同肌纤维类型形成的影响 摘要 肌肉是由不同类型的肌纤维构成，根据肌球蛋白重链的不同可将肌纤维类型分 为I型、IIa型、lib