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大青叶有效单体抗呼吸道合胞病毒作用的实验研究 【摘要】 　　目的探讨中药大青叶单体1#，2#，3#，4#体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用。方法通过观察病毒引起的细胞病变效应和MTT［Methyl Thiazolyl Tetrazolium，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐］法检测药物抗RSV活性, 计算 药物对病变的抑制率和半数抑制浓度，并从药物抗病毒吸附，药物对病毒的直接杀灭作用及抑制病毒在细胞内的生物合成3个方面初步探索大青叶单体抗RSV活性的作用机制。结果大青叶单体1#，2#，3#，4#对RSV无直接灭活作用,也不能阻止RSV的吸附，而能抑制RSV在Hep-2细胞内的的生物合成，其半数抑制浓度(IC50)分别为，，， μg/ml, 治疗 指数(TI) 分别为，，，，其抗病毒效果优于病毒唑(IC50= μg/ml, TI=)和抗病毒口服液(IC50= μg/ml, TI=) ，P 【关键词】 大青叶 单体 呼吸道合胞病毒 细胞病变效应法 MTT法  大青叶为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort的干燥叶。味甘，气寒，无毒，入肝、心、胃经，清热凉血，为解毒要药。《名医别录》记载：“疗时气头痛，大热，口疮。”《本草纲目》记载：“主热毒痢，黄疸，喉痹，丹毒。”它既能清心胃实火，治温热病心胃毒盛，发斑发疹，又善解毒利咽，凉血消肿，用治喉痹口疮、咽喉肿痛。据报道，大青叶在临床上多用于流行性感冒持续高热、上呼吸道感染、流行性乙型脑炎、急性传染性肝炎等病毒性疾病。而呼吸道感染中90%以上是由呼吸道病毒引起，其中呼吸道合胞病毒居首位［1］。鉴于此，我们从中药大青叶中提取有效成分，制备成大青叶单体，实验选用微孔细胞培养和MTT法，以Hep-2细胞作为体外筛选细胞模型，检测其对RSV的抑制作用，为筛选新型抗病毒药物和大青叶的临床应用提供思路和理论依据。  1 材料  中药大青叶单体1，2，3，4#，由华中科技大学同济医学院同济 医院 药剂科方建国教授提供。病毒唑和抗病毒口服液由南京第三制药厂生产，批号。Hep-2(鼻咽癌)细胞为武汉大学典型培养物保藏中心提供，RSV由英国Glasgow大学儿童卫生系Paton博士赠送。RPMI- 1640和 MTT为Hyclone公司产品。二甲基亚砜由上海菲达有限公司提供。新生小牛血清购自三利公司。  方法  .1 病毒滴度测定将毒株作10倍系列稀释，每个稀释度重复10孔，同时设正常细胞对照。于37℃下孵育h，换细胞维持液。每天观察细胞病变效应，约3～d后CPE不再增多时，按Reed-Muench方法计算TCID50。  .2 药物对细胞的毒性的测定用乙酶将生长良好的Hep-2细胞分散成单个细胞悬液，按1×105/ml浓度分种于40孔板，每孔 ml。置33℃，5%CO2培养箱中培养2h。待细胞长成单层后，弃培养液上清，换含不同浓度的含药维持液，每孔200 μl。大青叶1，2，3，4#单体的浓度分别为10，20，40，80，160，320，640，800，100 μg/ml。每种浓度重复4孔，实验同时设正常细胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑和中药抗病毒口服液对照。继续培养4h后，以MTT法检测细胞存活率。并根据如下公式计算细胞存活率，找出药物对细胞的最大无毒浓度范围。细胞存活率=×100%。  .3 细胞活性测定(MTT染色法)根据Mosmann建立的四甲基偶氮唑盐法测定细胞活性。弃培养上清液,每孔加mg/ml MTT的不含血清的RPMI-16400 μl，37℃,5%CO2孵育4～h, 黄色的MTT被活细胞的线粒体脱氢酶还原成蓝色的甲簪结晶，小心吸出MTT, PBS洗3次，每孔加50 μl DMSO终止反应,振荡混匀, 在1min后甲簪结晶被溶解,在波长570 nm下测定吸光度OD值。OD值与活细胞的数量呈正相关。  .4 药物抗RSV活性机理的实验   药物对RSV生物合成的抑制作用实验于已长成单层的Hep-2细胞40孔板上，每孔接种100 μl的100TCID50的RSV病毒液，于33℃吸附90 min，弃病毒上清。根据细胞毒性实验的结果，在大青叶无毒浓度范围内，加入2，4，8，16，32，64，12μg/ml的不同浓度的含药维持液每孔，每日观察CPE,隔天换新鲜含药维持液。实验同时设正常细胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑和抗病毒口服液对照。约在病毒对照CPE为 “+++～++++”时弃培养液上清，用MTT法检测病毒抑制率,并根据如下公式计算药物对RSV的病毒抑制率［2］。  病毒抑制率=药物处理组OD570-病毒对照组OD570细胞对照组OD570-病毒