兔大电导钙敏感性钾离子通道β亚基的克隆及生物信息学分析.docxVIP

兔大电导钙敏感性钾离子通道β亚基的克隆及生物信息学分析 作者：张孝勇，崔光彬，杜滂，马克军，王亚蓉，韩苇，颜真，张英起，魏经国  【摘要】 目的：克隆新西兰白兔大电导钙敏感性钾离子通道(BKCa)β亚基基因，观察其组织分布，并对其进行生物信息学 分析 . 方法 ：采用3′及5′cDNA末端快速扩增(RACE)及RTPCR技术从兔Oddi括约肌(SO)组织获得BKCa通道β亚基的全长cDNA序列. 并 应用 生物信息学方法分析该基因的同源性、蛋白结构域及跨膜拓扑结构. 结果：兔BKCa通道β亚基基因cDNA全长为116bp，开放读窗长度为57bp，编码191个氨基酸. 生物信息学分析表明该基因核酸序列及氨基酸序列与人类及其它哺乳动物有很高的同源性；拓扑结构为两次跨膜蛋白，具有4个功能结构域，含有1个磷酸化位点及2个N糖基化位点. 结论：首次成功地从兔SO组织克隆出BKCa通道β亚基基因，获得新GenBank号 DQ，为进一步 研究 该基因的功能奠定了基础.  【关键词】 钙敏感性钾离子通道  0引言  大电导钙敏感性钾离子通道(large conductance Ca2+ sensitive K+ channels, BKCa)广泛分布于平滑肌细胞(SMC)，其主要生理作用是调节SMC膜电位和肌张力［1］. BKCa通道是由α亚基和β亚基共同组成，其中α亚基是结构亚基，构成孔道，表达量较恒定；β亚基是调节亚基，可提高通道对钙离子的敏感性，表达量的高低同该通道的功能状态密切相关［2］. 但 目前 GenBank尚未发布兔BKCa通道β亚基的基因序列，因此获得这段基因序列成为下一步研究的关键. 我们根据已知新西兰白兔部分组织BKCa通道β亚基保守区序列(GenBank Number: AB, AF, AY)设计引物，直接体外扩增兔Oddi括约肌(sphincter of Oddi, SO)细胞BKCa通道β亚基基因的cDNA全长序列，并采用生物信息学方法对该基因的特征进行分析.  1材料和方法  材料新西兰白兔8只， 雌雄不拘， 体质量～； Trizol RNA抽提试剂；3′及5′ RACE试剂盒First Choice RLMRACE Kit；DNA Marker，RTPCR Kit，TDNA连接酶，Taq酶，pMD18T载体，限制性内切酶等；IPTG，Xgal；琼脂糖凝胶回收试剂盒及产物纯化试剂盒；PCR仪；寡核苷酸引物合成及测序由北京三博生物技术公司完成.  方法  兔SO细胞总RNA的提取经兔耳缘静脉快速注入约10 mL空气将兔处死，快速锐性无菌分离SO段，取出后用4℃生理盐水冲洗. 于解剖显微镜下刮除浆膜及结缔组织，纵形切开SO段，刮去黏膜组织，用组织剪将其剪成约100 mg小块，加入4℃ Trizol 1 mL中. 使用高速组织匀浆机将组织块完全粉碎后，4℃离心10 min，弃沉淀，将上清转移至新的1 mL离心管中. 按照Trizol一步法取试剂盒说明进行RNA的提取. 抽提出的RNA经凝胶电泳鉴定RNA质量，于紫外分光光度计260 nm和280 nm处鉴定RNA的纯度及浓度.  ′及5′ cDNA末端快速扩增严格按照试剂盒说明书操作，所采用引物见表1.′ RACE的主要步骤及反应条件：① 1 μg总RNA经CIP和TAP处理；②连接5′ RACE接头；③′ RACE readycDNA；④巢氏PCR扩增：以5′ Race readycDNA为模板，以试剂盒提供的5′ RACE Outer Primer和5′ RACE Inner Primer为上游引物，在序列保守区设计了2条下游引物5OGP和5IGP.′ RACE第1轮PCR反应采用引物5OP和5OGP，反应条件为:4℃ min；94℃0 s，62℃0 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ min. 取第1轮PCR产物mL进行第2轮PCR反应，引物为5IP和5IGP，反应条件为:4℃ 1 min；94℃0 s，68℃0 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min.′ RACE的主要步骤及反应条件： ①′ RACE readycDNA；②巢氏PCR扩增：以3′ RACE ready cDNA为模板，以试剂盒提供的3′ RACE Outer Primer和3′ RACE Inner Primer为上游引物，在序列保守区设计了2条上游引物3OGP和3IGP.′ RACE第1轮PCR反应采用引物3OP和3OGP，反应条件为:4℃ min；94℃0 s,8℃0 s,2℃ 1 min,5个循环；72℃ min. 取第1轮PC