温州医学院药学院生物技术制药课件第三章 基因工程制药（2）.pptVIP

第二节 基因工程的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶 一、限制性核酸内切酶 是一类能识别特殊核甘酸序列，并水解DNA分子的磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵 作用。 （一） 限制性内切酶的来源 寄主控制的限制（restriction） 与修饰 (modification) 现象： 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。 R/M体系： 是由两种酶活性配合完成的： 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶 E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 ※当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 ※EcoB(大肠杆菌B株)的核酸酶不能识别已甲基化 的序列。 ※限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。 ※由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。 为此，W.阿尔伯，H.史密斯和D.内森斯三人共同获得了1978年诺贝尔生理学或医学奖。 （二） 限制性内切酶的分类与命名 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶 Ⅰ型酶： ※ 1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。如 EcoK 和 EcoB ※分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。 Ⅰ类酶虽然能够在一定序列上识别DNA分子, 并能同DNA分子作用, 因其识别DNA后, 要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为1000个碱基左右)，并且要形成一个环才能切割DNA, 所以识别位点和切割位点不一致，产生的片段较大。 这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。 Ⅱ型酶 ※1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。 ※分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。 识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。 许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。 Ⅲ型酶 这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的下游的24~26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的。 各种限制与修饰系统的比较 限制性核酸内切酶的命名 限制性核酸内切酶的命名原则： 第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。 例：EcoR I: 来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶。 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 H i n d III d株中发现的第三个酶 （三） II型限制性内切酶的基本特征 1. 基本特征 1.识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列 2. 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 3.识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 ？？ II型限制性内切酶的基本特征 粘性末端 平末端 同裂酶 同尾酶 限制性内切酶在DNA克隆中的应用 第二节 基因工程的工具酶 一、限制性核酸内切酶 二、DNA连接酶 三、DNA聚合酶 四、核酸酶 五、核酸修饰酶 ＤＮＡ连接酶 能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（ OH ）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。 只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。 连接酶的作用机理 连接酶先与ATP作用，以共价键相连生成E-AMP中间体。中间体即与一个DNA片段的5‘-磷