肽化学研究中的高效液相色谱.PDF

讲 座 高效液相色谱在生物医药研究中的应用（） 肽化学研究中的高效液相色谱 唐 易全 （中国科学院上海药物研究所，200031） 七十年代中期以来，色谱学家逐步建立起包括 作用，氢键和静电吸引等。改变流动相中的离子添 反相HPLC的一整套色谱方法，并运用这些方法 加剂，有机溶剂的类型和／或浓度以及pH值等， 在肽的分离纯化，制备，定性定量分析，分子量测 都会影响上述吸附位点，从而引起肽分子色谱保留 定，肽结构与其色谱保留值关系等方面进行了深入 值的变化[2]。本文主要叙述影响肽色谱保留性质 的研究。八十年代以来，HPLC在肽化学研究领 的诸因素。 域得到了广泛应用，取得突破性进展。主要表现 在反相HPLC中，肽的保留时间可用氨基酸 在，人们利用HPLC并与其它方法相结合，发现 及其端基的“保留常数”的加和值来预测。所谓保 了许多新的天然活性肽，特别是神经肽。如作者自 留常数，是一类表示氨基酸疏水性质的经验常数。 8388年不完全统计，已确定一级结构的新活性 它们是在一定色谱条件下，若干肽的保留时间，与 肽，平均每年不少于40个。如今，不用HPLC而发 组成肽的氨基酸和端基对肽保留时间的贡献之间进 现新天然肽的报道已很少见。这许多新肽的发现， 行统计处理后得到的。肽分子中各氨基酸保留常数 为紧随而来的关于这些肽的前体蛋白的生物学研 加和值越大，该肽的保留时间就越长。对小于二十 究，肽的受体研究，肽的药理和病理以及结构功能 个氨基酸残基的肽，预测值与实验值之间有良好的 研究，肽的工业生产和基因工程等方面起了带头 线性关系。如大白鼠神经垂体中25个神经肽保留时 作用。而在这些继之而起的工作中，也还得使用 间的计算值与实测值之间的相关系数为0.998，（三 HPLC这一技术。 氟醋酸系统）和?0.994（七氟丁酸系统）[3]。上述 分离纯化肽的最常用方法是反相HPLC。这 关系对大肽不适用。因大肽的立体位阻限制了氨基 是因为：1．此方法以水为基本组成部分，这与肽的 酸与固定相表面的接触。表2-1给出常用HPLC系 生物学性质很相宜。虽然流动相中的酸和有机溶 统中各氨基酸及端基的保留常数。 剂，以及固定相均可能使肽的天然构象发生变化， 但当这些因素除去后，肽的构象一般能恢复原状。 2-2 反相高效液相色谱[4-7] 因此在反相HPLC中，肽的活性回收率是很高的， 固定相。在肽的分离中，常用的固定相为十八 一般在80%以上[1，2．与其它分离方法比较，反相 烷基、八烷基、苯烷基和氰基键合相硅胶。硅胶上 HPLC的分辨力更强，适用范围更广泛。另外， 的键合相为单层时的分离效果比多层聚合状的好， 离子交换HPLC也是分离纯化肽的有效方法。 未参加键合反应的残余硅羟基被掩蔽后有利于肽的 目前，生物大、中分子的HPLC研究，取得 洗脱，但又可能降低分离选择性。由于肽分子比一 的经验较为成熟，存在麻烦较少的，或许要算肽分 般有机化合物分子大，分离肽的色谱填料的孔径必 子的HPLC研究。 需在10nm以上，才能保证有合适的回收率和分离 度。分子量很大的肽，如三十个残基以上者，用孔 2-1 色谱作用机理 径30nm的填料则更好。色谱柱的长度为15cm左 在反相与离子