毕业论文：1__5-戊二胺谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建.docVIP

1, 5-戊二胺谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建 摘要 1, 5-戊二胺是一种重要的化工原料, 发酵法生产1, 5-戊二胺是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径。以蜂房哈夫尼菌AS1. 1009基因组为模板, 通过PCR 扩增, 得到大小约为22 kb的赖氨酸脱羧酶基因ldc。以大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXM Jl9为载体, 将扩增得到的目的基因片段克隆至谷氨酸棒杆菌C. glu tam icum TK260512, 获得重组菌株C. glutam icum TK260512 /pXMJl9-ldc. 在摇瓶发酵水平上, 通过IPTG 诱导ldc基因的表达, 并采用反相高效液相色谱方法测定了发酵液中1, 5-戊二胺的含量, 结果显示, 经36h发酵, 工程菌C. g lu tam icum TK260512 /pXMJ19-ldc的1, 5-戊二胺产量为0.96 g/L。 关键词 赖氨酸脱羧酶 谷氨酸棒杆菌 1, 5-戊二胺 正文 1, 5-戊二胺, 即尸胺是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱, 为蛋白质腐败时赖氨酸在脱羧酶作用下发生脱羧反应时生成。在农业上, 产物1, 5-戊二胺可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育, 改善植物果实发育, 提高果实产量[ 1, 2] ; 在医学上, 它也可作为一种有效治疗痢疾的药物[3]; 在工业上, 将1, 5-戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料——新型尼龙[4] 。此外, 1, 5-戊二胺是微生物细胞内调节铁离子浓度的“铁亲和系统”的主要组成成分[5] ; 1, 5-戊二胺在关闭孔蛋白通道方面也起着重要的作用[6] ; 而且它还是反刍兽新月单胞菌(Selenom onasrum inantium )、嗜碱性韦荣球菌( Veillonella alcalescens),小韦荣球菌( V. parvula), 和解脂厌氧弧菌(A naerov ibriolipolytica)等一些严格厌氧的格兰氏阴性菌的肽聚糖的组成成分[ 7-9] 。 自20世纪30年代, 杜邦公司发明出尼龙以来, 尼龙就以其优异的力学性能, 良好的耐磨性和自润滑性,较好的耐腐蚀性等优点被广泛应用于航空航天, 汽车部件、机械零部件、电子电器、包装材料、胶粘剂及化妆品等领域。每年全世界大约生产1 200000吨尼龙, 其中尼龙-6和尼龙-66约占90%。尼龙66是由己二胺和己二酸1：1聚合生成。1, 5-戊二胺是赖氨酸脱羧的产物, 与己二胺互为同系物, 在结构上与己二胺非常相似, 可以替代由石油制备的己二胺, 已有技术可以将尸胺精炼后和己二酸共聚合成具有实用性的尼龙-56, 尼龙-56是一种耐高温的新型塑料[4]。 1, 5-戊二胺化学合成法采用以不可再生的战略石油作为原料, 环境污染严重, 无法实现可持续发展。利用生物法转化可再生资源来生产1, 5-戊二胺, 具有污染小, 环境友好, 可持续发展等优点, 如果我们能成功开发出利用微生物转化可再生资源来生产1, 5-戊二胺的方法, 这无疑会在缓解能源危机和遏制全球气候变暖等方面做出重要贡献。生物法制备1, 5-戊二胺在国外也正处于起步阶段[10-11]。国内只有蒋丽丽等[ 12]利用固定化能产赖氨酸脱羧酶的蜂房哈夫尼菌细胞来制备1, 5-戊二胺的报道。然而蜂房哈夫尼菌不能积累赖氨酸, 需要外加赖氨酸作为酶的反应底物, 故仍无法解决原料成本过高的问题。因此构建以廉价的葡萄糖为底物直接生产1, 5-戊二胺的基因工程菌成为研究的热点。本课题将克隆得到的蜂房哈夫尼菌的赖氨酸脱羧酶基因连入表达载体pXM J19得到重组质粒pXM J19-ldc。用电转化方法将重组质粒pXM J19-ldc 转入一能产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌体内, 使赖氨酸直接在体内脱羧生成1, 5-戊二胺。此课题在实验室水平上初步探讨了用转基因工程菌生产1, 5-戊二胺的方法, 为今后我国拥有自主知识产权的1, 5-戊二胺工业化生产技术奠定基础。 1 材料与方法 1.1 菌株和质粒 蜂房哈夫尼菌购自科学院微生物研究所。C质粒pGEM -T Easy购自Promega公司。 1.2培养基、酶及试剂 大肠杆菌在LB培养基中培养, 谷氨酸棒杆菌种子培养基及摇瓶发酵培养基的配制参照文献[13] 。TaqDNA聚合酶、PCR 其它试剂、限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、X-gal、IPTG均购自大连宝生物工程公司;低熔点琼脂糖回收试剂盒、氯霉素( Cm )、氨苄青霉素(Amp)购自上海生工生物工程技术服务有限公司; 1, 5-戊二胺衍生化试剂2, 4-二硝基氟苯为Alpha公司产品;高效液相色谱中使用的甲醇和乙腈等为国产的色谱纯溶剂; 其它试剂为国产或进口的分析纯产品。 1. 3 Hafni