毕业论文：《应用RT-PCR方法克隆FMDVGZ株P1和3C基因，连接IRES，成功构建了重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-P1-IRES-3C》.doc

PAGE 1 前 言 1 FMD与FMDV概况 FMD（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性和可远距离传播的动物传染病，被国际兽疫局（OIE）列为A类动物传染病之首，我国也将其列为第一类动物传染病的第一位。本病可感染70多种家畜和野生动物，最易感动物包括牛、猪、羊、骆驼和鹿等，致死率不高（幼畜除外），但可引起动物生产性能下降，并且爆发时影响国际贸易，往往造成严重的直接和间接经济损失，如1997年我国台湾、2000年日本和韩国、2001年英国爆发的FMD，都给该地区或该国的畜牧业带来了沉重的打击，并造成不可估量的间接经济损失（Samuel et al，2001）。FMD可以通过空气（King et al，1981）、急性或持续感染的野生动物（Vosloo et al，1996）和感染的动物或动物产品、农具等传播。 FMDV属于微核糖核酸病毒科（Picornaviridae）中的口蹄疫病毒属（Aphthavirus）。病毒粒子直径为23-25nm，呈圆形或六角形，由60个结构单位构成二十面体。通过交叉保护试验和血清学试验确定FMDV有7个血清型，即O、A、C、AsiaⅠ和SAT1、SAT2、SAT3，和65个以上的血清亚型。根据7个血清型之间的同源性可将其分为两群，O、A、C和AsiaⅠ型为一群，SAT1、SAT2、SAT3型为另一群，两群之间的血清型同源性仅为25-40%，群内同源性可达60-70%，血清型之间无交叉保护反应。除已基本消失的C型外，O型和A型FMDV的毒力和抗原性易发生变异，几乎遍布亚、非、拉、欧各大洲；SAT1、SAT2、SAT3主要分布在非洲；AsiaⅠ型主要分布在亚洲。FMDV基因组为长约8.5kb的单股正链RNA，具有单一的开放阅读框（ORF），由L基因、P1结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因以及起始密码子和终止密码子组成，该ORF翻译产生的多聚蛋白前体在病毒自身编码的蛋白酶作用下，加工成病毒粒子组成和复制所需要的结构蛋白及非结构蛋白。病毒蛋白P1-2A前体由3C蛋白酶裂解为VP0、VP1和VP3，这些蛋白能够自我组装成二十面体的病毒衣壳，随着VP0裂解为VP2和VP4，病毒RNA整合进入病毒衣壳形成完整的病毒粒子（Abrams et al，1995）。缺乏核酸的病毒衣壳能够诱导产生与完全病毒粒子相同的特异性中和抗体。 世界动物及畜产品市场根据口蹄疫流行情况被划分为两个部分，即无FMD国家和有FMD国家。无FMD国家在家畜和动物源性食品出口方面具有绝对的优势，如澳大利亚、新西兰、加拿大等国，其动物产品在国际市场上不仅大受欢迎而且价格不菲。所以控制FMD一直是各国政府关注的焦点，扑杀和免疫接种是防控FMD最有效最常用的办法。如阿根廷、巴西在南美洲FMD消灭计划的支持下，FMD的控制和消灭取得了很大的成果，其中阿根廷曾一度宣布对家畜不再注射FMD疫苗。但2001年FMD在阿根廷和英国又重新暴发，说明了控制FMD的复杂性和艰巨性，因而需要对本病的流行机理进行更加深入的研究。 2 FMDV P1、3C基因及其功能 FMDV基因组容易发生变异，产生多种基因和抗原变异株。在野外存在的多种FMDV抗原变异株被称为类群。FMDV类群的存在是因为病毒极高的基因多样性。FMDV基因组为单股正链RNA，基因容易突变，导致抗原变异。其复制没有纠错机制，平均每复制一次每个核苷酸的变异概率是10-5-10-3。衣壳蛋白VP1、VP2和VP3都与抗原变异有关（Kittson et al，1993）。对流行毒株VP1、VP2和VP3调查表明，在两年半时间内采集的10个A型FMDV流行毒株，发现每个毒株至少有一个氨基酸差异（Marquardt and Freiberg，2000）。这使得野外流行毒株的基因突变株的数量增加很快。衣壳蛋白编码区密码子突变后，病毒子后代适者生存，存活下来能遗传的占全部突变株1-7％。FMDV在细胞培养中也会出现基因和抗原变异，随着传代次数增加，其变异也逐渐增加（Diez et al，1989）。在FMDV感染细胞死亡或持续感染过程中，抗原随机漂移，病毒类群中适者生存，优胜劣汰，形成优势类群。 FMDV衣壳蛋白前体P1由3C蛋白酶裂解为VP0、VP1和VP3，自我组装成二十面体的病毒衣壳，然后VP0裂解为VP2和VP4。在VP1、VP2、VP3、VP4这4种结构蛋白中，与产生中和抗体及抗感染有关的主要是VP1（殷震，刘景华，1997）。在已发现的O型FMDV的五个抗原位点中，有三个位于V