蜡梅小GTP结合蛋白基因CpRAC1的克隆及功能初步验证-风景园林学专业毕业论文.docxVIP

研究生优秀毕业论文 西南大学硕士学位沦文3．2．2蜡梅CpRACl基因cDNA序列的获得 西南大学硕士学位沦文 3．2．2蜡梅CpRACl基因cDNA序列的获得 ．19 3．2．3蜡梅CpRACl基因的生物信息学分析 一22 3．3结果与分析 22 3．3．1蜡梅(力删C，基因cDNA的获得及其序列特征 ．22 3．3．2蜡梅@RACJ基因编码蛋白的基本特征预测分析 一24 3．3．3蜡梅CpRACl基因编码蛋白的同源性分析 ．．25 3。3．4蜡梅@RACl基因编码蛋白的聚类分析 ．．26 3．3．5蜡梅CpRACl蛋白与拟南芥RAC蛋白的聚类分析与多重序列比对 ．28 3．4讨论 29 第四章蜡梅CpRACl基因的表达特性分析 ．31 4．1实验材料 3l 4．2实验方法 31 4．2．1蜡梅不同组织、不同时期及不同胁迫处理材料的采集 ．31 4．2．2总RNA的提取及cDNA第一链的获得 ．．32 4．2．3 CpRACI基因表达特性的实时荧光定量分析 ．．32 4．3 结果与分析 ．34 4．3．1蜡梅总RNA提取 ．．34 4．3．2 C匆魁C，基因的表达特性分析 34 4．4讨{仑 ．．40 第五章蜡梅c≯肌cJ基因表达载体的构建及拟南芥遗传转化研究 41 5．1实验材料 41 5．1。1植物材料 一41 5．1．2载体及菌株 ．41 5．1．3试剂盒及主要试剂 ．4l 5．1．4自配的主要试剂 ．41 5．2实验方法 42 5．2．1蜡梅CpRACl基因植物超表达载体的构建 ．42 5．2．2农杆菌EHAl05冻融法感受态的制备 ．44 5．2．3冻融法转化农杆菌EHAl05感受态细胞 一44 5．2_4农杆菌转化子的PCR鉴定及反转化大肠杆菌鉴定 44 5．2．5花序侵染法转化拟南芥 ．．45 5．2．6转基因拟南芥的筛选鉴定 ．46 5．2．7转基因拟南芥的表型观察 ．47 5．2．8转基因拟南芥的花粉离体萌发 ．．48 ii 万方数据 目录詈昌曼曼量曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼寡曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼詈詈鲁皇詈I 目录 詈昌曼曼量曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼寡曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼詈詈鲁皇詈I I■曼置●罾曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼 5．2．9转基因拟南芥的激素胁迫处理 48 5．2．1 0类黄酮和叶绿素含量测定 48 5．3结果与分析 ．．48 5．3．1蜡梅C≯础Cj基因植物表达载体的构建 ．48 5．3．2转基因拟南芥的筛选鉴定 50 5．3．3转基因拟南芥表型观察 ．52 513．4过表达Cp删C，基因影响拟南芥生长发育原因初探 54 5．4讨{仑 59 5．4，1蜡梅Cp心Cj基因参与拟南芥植株衰老的调控 ．59 5．4．2蜡梅CpRaCl基因影响相关生物学性状 ．6I 第六章 总结 ．．63 6．1主要结果 63 6．2下一步计划 64 参考文献 65 缩略词表 75 致谢 ．．77 在校期间发表文章和参研项目 79 万方数据 西南大学硕士学位论文 IV 万方数据 摘要蜡梅小GTP结合蛋白基因蚴C，的克隆及功能初步验证 摘要 蜡梅小GTP结合蛋白基因蚴C，的克隆及功能初步验证 风景园林学专业硕士研究生：门维婷 指导教师：眭顺照教授 李名扬教授 捅要 蜡梅[Chimonanthuspraecox(L．)Link]为蜡梅科落叶灌木，是我国的传统名花， 冬季开花，花香馥郁，是冬季作为切花材料的最佳选择。具有较高的经济价值和 观赏价值。目前对蜡梅抗逆性和花发育的分子机制已有所研究，但是对蜡梅生长 发育调控机理的研究较为匮乏。 Rac／Rop蛋白作为植物小GTP结合蛋白家族的成员之一，在细胞信号传导途 径中起着“分子开关”的作用，其通过在GTP激活态和GDP失活态之间的周期性循 环与不同的调控因子和下游效应因子相互作用，在植物中执行不同的生物学功能。 如与植物的极性生长、抗病抗逆性、激素信号传导、活性氧的产生以及细胞的凋 亡等密切相关。 在对蜡梅EST序列进行分析的基础上，发现克隆子CH2097对应的EST序列 DW0533被注释为小GTP结合蛋白基因，其在蜡梅中的功能还值得探讨。因此， 本实验从已构建的蜡梅花eDNA文库中成功分离获得该基因，命名为CpRaC』。并 对其结构特征、编码蛋白特征和表达特性进行分析，同时构建植物表达载体通过 拟南芥异位表达进行相关研究，以明确其功能。主要试验结果如下： 1．印删a基因的结构特征和编码蛋白特征 在已构建的蜡梅花eDNA文库EST分析的基础上，通过随机测序的方法分离 获得@RACJ『基因的eDNA序列。获得的eDNA序列包含1个597bp的完整开放 阅读框(Open Reading Frame，ORF)；ProtParam软件