核酸分离纯化_经典版.pptVIP

荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV 激发下发出红色荧光。荧光强度的强度与溶液中核酸的含量呈正比。 使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。 （五）核酸的鉴定与保存 EB与DNA的结合 浓度鉴定 紫外分光光度法： 主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。 纯度鉴定 （五）核酸的鉴定与保存 纯度鉴定 （五）核酸的鉴定与保存 判断核酸样品的纯度： DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 比值降低：蛋白质污染（280）、酚污染（270） 比值升高：DNA变性、RNA污染 混合污染：比值正常 荧光光度法： EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品的纯度。 （五）核酸的鉴定与保存 纯度鉴定 琼脂糖凝胶电泳： 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性； 根据电泳条带的数目、位置和形状判定，RNA分子可以通过荧光强度强弱来判定有无降解。 基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状。 完整性鉴定 （五）核酸的鉴定与保存 DNA的降解 （五）核酸的鉴定与保存 完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，原核生物5S、16S、23S三条带；真核生物：5S和5.8S、18S、28S三条带；而且三条带荧光强度应呈特定的比值。 沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高 沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低 （五）核酸的鉴定与保存 完整性鉴定 28S（或23S）RNA的荧光强度一般约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解； 若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染。 （五）核酸的鉴定与保存 核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： 4℃ 样品经常使用 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存,避免反复冻融 保存介质： 灭菌水 TE缓冲溶液(最常用)： 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 （五）核酸的鉴定与保存 2. 核酸的保存——DNA的保存  DNA样品溶于pH8.0的TE缓冲液中，4℃或-20℃保存，-70℃冰箱可保存数年。 TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低7.0时DNA易变性 长期保存样品中可加入1滴氯仿。 （五）核酸的鉴定与保存 2. 核酸的保存——DNA的保存 RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。 （五）核酸的鉴定与保存 2. 核酸的保存——RNA的保存 A：测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注： 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。 测定结果分析 B：测RNA 纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2.0。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； 3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。 谢 谢！ 放映结束 感谢各位观看！ 让我们共同进步 核酸的分离纯化技术 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。 概 述 一、核酸分离、纯化原则 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 1.意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 2. 实验过程中，应注意以下条件及要求： 1）减少化学因素对核酸的降解:pH4-10 2）减少