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Taqman法荧光PCR引物探针设计 与目标序列互补 实时荧光定量PCR TaqMan法 TaqMan---水解型杂交探针 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 TaqMan法工作原理 每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光 TaqMan 法 PCR反应的建立 1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70℃ ，20－30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为58-60℃ 2、反应参数的确定： 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ℃，45 S， 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同 总体原则 查阅参考文献，以选取 待检病原体的靶基因。 目的基因序列大量查找，利用DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA比对，确定种内高保守，种间高特异的区域为设计引物探针的靶序列 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G） 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。 　 探针设计原则 探针位置尽可能地靠近上游引物 探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性 检测探针的DNA折叠和二级结构 Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70% 探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5‘G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。 　 引物设计原则 序列选取应在基因的保守区段 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构? 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60% 引物之间的TM相差避免超过2℃ 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp? 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。 　 TaqMan法优缺点 对目标序列的高特异性 -----阴性结果确定 设计相对简单 ------与目标序列某一区域互补 重复性比较好 优 点 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针 缺 点 TMA检测技术示意图 TMA扩增反应原理图 技术原理 同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧