HE石蜡切片步骤-使用.doc

石蜡切片制作 一、苏木精-伊红对染法 ——paraffin section 一、器材及试剂： 1. 器材： 切片刀，切片机，恒温箱，蜡杯，酒精灯，解剖刀，解剖剪，解剖盘，培养皿，镊子，单面刀片，毛笔，包埋盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。 切片机，切片刀，温台，恒温箱，解剖刀，镊子， \o 医学百科：剪刀 剪刀，解剖针，单面刀片，小台木，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，烧杯，水盆，熔蜡炉，蜡杯。 2．试剂： 中性福尔马林固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、苏木精染液， 1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。 卡诺（Carnoy）固定液，埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸 \o 医学百科：乙醇 乙醇液，各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，中性树胶。 3. 材料： 鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。 二、实验原理： 石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。 三、试剂配法： 1．中性甲醛固定液： 甲醛（37%-40%，市售，本所购买即为此浓度） 100mL 磷酸氢二钠 6.5 磷酸二氢钾（钠） 4g 双蒸水 900mL 2．苏木精、伊红染色液为碧云天产品 3．1%盐酸乙醇液 盐酸 1份 70%酒精 100份 四、实验步骤： 1．取材 颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2－3mm厚。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。 2．固定 将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30－50min。（4度过夜） 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。 （3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。 （4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 3. 洗涤 材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。 4. 脱水 材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次各20min。 注意事项： （1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 （2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。 （3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 （4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。 （5）如需过夜，应停留在70%酒精中。 （6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象 5．透明 纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明为止）。 由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。 透明注意事项 （1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。 （2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收