利用肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体条件性敲除基因-生物学专业论文.docxVIP

中文 中文摘要 重庆大 重庆大学硕士学位论文 I I PAGE PAGE VI 摘 要 RNAi 是在生物进化上高度保守的特异性转录后基因沉默过程，并已经成为强 大的基因操作工具。它几乎可以用来研究任何一种基因的分子途径以及表型和基 因型之间的关系。但仍存在些许不足之处，严重限制了 RNAi 在基因治疗领域中的 广泛应用。其中 RNAi 在时间和空间上的不可控性以及非靶向性是需要亟待解决的 难题。诱导型 RNAi 技术可以通过诱导物介导 shRNA 的表达进而实现对靶基因的 有效调控。与诱导型调控系统结合的 RNAi 体系作用机制更精细，这可能会开辟出 一个更广阔的应用领域。本研究选取合适的热休克元件和肿瘤特异性启动子，将 两者有效结合，构建一种温度诱导型的 RNAi 质粒载体。具体实验内容和结果如下： ① 选择 hTERT 肿瘤特异性启动子的核心序列，它几乎只在大多数的癌症细 胞中启动表达。热休克蛋白启动子中含有可以响应热的热休克元件，实验中选择 三种热休克元件：一种来源于小 HSP 家族的 Hsp27 ； 另 一 种 是 三 个 “NGAAN-NTTC”HSE 基 本 单 位 的 重 复 排 列 ； 最 后 一 种 是 由 “AGAAC” 和 “GTTCT”交替排列得到的 HSE 序列。将 HSE 序列可以插入到 hTERT 启动子序 列-65 和-85 位点之间或者放在首位。 ② 构建 phTERTp-EGFP、phTERT/HSE（AB）p-EGFP、phTERT/HSE（MN） p-EGFP 和 phTERT/HSE（XY）p-EGFP 四种质粒，并将其转染至 MCF-7 细胞中， 通过检测 EGFP 的蛋白表达量比较不同启动子的启动能力。数据显示 hTERT/HSE （MN）和 hTERT/HSE（XY）启动子既可以降低 hTERT 启动子的本底表达水平又 可以很好的响应过高热。此外，这两种启动子在 HaCaT 和 HL7702 人正常细胞中 表达 EGFP 的量远远低于 Hsp70 启动子，这表明所构建的 phTERTp-EGFP 和 phTERT/HSEp-EGFP 质粒具有良好的肿瘤特异性。 ③ 构建 pMhTERTpsiSNCG 和 pMhTERT/HSEpsiSNCG 质粒载体，并选择 MCF-7 和 HepG2 为实验细胞，以 SNCG 为靶基因，分别从 RNA 和蛋白水平上检 测这种表达系统的敲除效果。实验结果显示无论是在 MCF-7 还是在 HepG2 细胞中， pMhTERT/HSE（MN）psiSNCG 和 pMhTERT/HSE（XY）psiSNCG 质粒在 37℃条 件下几乎不能敲除 SNCG，而当经历过热诱导，这两种质粒沉默 SNCG 基因的能 力明显提高，敲除率分别在 50% 和 60%以上。 关键词：hTERT 启动子，热休克元件，siRNA，热激，基因治疗 英文摘 英文摘要 重庆大 重庆大学硕士学位论文 III III PAGE PAGE IV ABSTRACT RNAi is a highly conserved regulatory process that exerts the specific post-transcriptional gene silencing observed in a variety of species, and it has been already exploited as a powerful tool for genetic manipulation. It allows researchers to silence virtually any gene to elucidate molecular pathways and phenotype/genotype relationships. But there are many obstacles and concerns that prevent RNAi from being widely used in gene therapeutic field. Among them, the non-spatial and non-temporal control is the primary limitation, as well as off-target effects. Inducible RNAi technology can effectively regulate target gene by inducer mediated shRNA expression. Combination with inducible regulation system make