利用电子差异展示方法克隆人类睾丸高表达新基因SPATA11及其功能的初步研究-遗传学专业论文.docxVIP

摘要精子生成是一个多基因参与的复杂过程，多个与精子发生相关的 摘要 精子生成是一个多基因参与的复杂过程，多个与精子发生相关的 基因，如位于Y染色体AZFa区的USP9Y基因和DBY、AZFb区的RBM 基因、AZFc区的DAZ基因以及常染色体上的环AMP反应元件调节子 (CREM)、雄激素受体基因、热休克蛋白HSP70-2、ODF2、DAZLA、ZFPl48 等己被鉴定。但这些已知的基因如何与其它的基因相互作用来调控精 子的生成过程，以及是否存在其它未知的基因参与精子的发生目前尚 不完全清楚。克隆新的睾丸发育、生精相关基因是进一步了解生殖细 胞发生机理和生物学过程的关键，对阐明精子发生的生理、病理具有 重要意义。 随着人类基因组计划的深入和发展，越来越多的基因组信息被释 放出来，利用网上的各种生物信息资源进行新基因克隆已经成为新兴 的基因克隆策略——电子克隆，表达序列标签也已经成为寻找未知功 能新基因，以及克隆不同时空差异基因和疾病相关新基因的重要标志 物。我们在此基础上，借助公共ESTs数据库，利用NCBI中的电子差 异展示(digital differential display，DDD)软件，从筛查人类 睾丸中有高表达而在其他组织中不表达或低表达的差异ESTs入手， 成功克隆到一个在人类睾丸中高表达的新基因SPATAll，并对该基因 的功能进行了初步研究。 第一章利用电子差异展示方法获得睾丸组织高表达基因谱 在NIH生物信息中心UniGene中选择来自睾丸(包括睾丸癌) 的EST文库与来自其它组织(包括该组织来源癌组织)的EST文库 的EST文库与来自其它组织(包括该组织来源癌组织)的EST文库 分别作为A、B两组文库群。A组文库群来源于菲肇丸组织，包含文 露共215个，Clustered EST 1716455条，B维文痒群来源予睾丸缀织 共4个文瘁，包含Clustered EST 45969条，测用DDD软l牛定量分辑 代表各基因的EST在各组文库中出现的频次，并经过统计学分析， 获得两组文库间有统计学意义的差异表达基因共473个，其中在非睾 丸缝织来滚EST文库中窝表达懿有110个，余下静363个褒睾丸缀绥 来源EST文库中菇表达。在睾丸文库中高表达魄EST中有132个为已 知基因，按其功能可以归于酶、受体／膜表面分子、结合蛋白、分泌蛋 白等，余下的可能代表新基因。 第二牵SPATAll基因的克隆与序剜生物信慧学分耩 在DDD获褥的睾丸组织文库高表达的363个EST族中，对 Hs．I l 1099进行分析，该EST族中包含的EST拼接后获得～个长度为 1141bp的序列，利用Blast检索nr数据库，认为该序列代表一个新基 因。根据拱羧后豹侉列设计三对弓|物，以成人牵丸cDNA为模板进行 PCR扩增，三对引物均扩增出特异性产物，大小及测序结果与预测耀 符，说明该EST确实在睾丸组织有表达。Northern blot结果显示新基 因在牵丸组织高表达，转录本大小为1．1kb。该基因已提交至Genebank (登录号为AY427650)，并命名为SPATAll。生物信惠学分叛显示 SPATAll基因定位在19p13．3，呶4个外显子和3个波含子所组成， 基因组跨越2．6kb，编码221个氨基酸，分子髓约为24．5kD，与已知 蛋白质无明显同源性。SPATAll蛋白最大可能是一种胞浆蛋白(47．8 Ⅱ ％)。在SPATAll基因的5 ％)。在SPATAll基因的5 7端和第一外显子内存在1个CpG岛，位 于．88蛰J+593bp，共681 bp，其GC含量为62．1％。 第三章SPATAll基因功能的初步研究 RT．PCR显示SPATAll基因在98天、4+月、5+月胚胎睾丸组织中 表达量维持在较低水平，8+月胚胎睾丸组织中表达量开始上升，到成 人阶段达到最高，同时SPATAll基因在胚胎干细胞中也有较高水平的 表达。原位杂交以及免疫组化显示SPATAll基因在正常成人睾丸组织 各级生精细胞以及精原细胞癌组织中均有较高表达，在4+月胚胎睾丸 组织中表达量较低。隐睾组织中SPATAll基因的表达明显下调。在唯 支持细胞综合征患者睾丸组织中未检测到SPATAll基因的表达。 pEGFP—C2／SPATAll融合表达载体的细胞转染实验证明SPATAll基因 编码产物在胞浆和胞核内均有表达。利用pQE30表达载体成功地诱 导了SPATAll融合蛋白在原核系统中的表达，并纯化了该带六个组氨 酸的融合蛋白，为进一步制备其特异性抗体奠定了基础。SPATAll基 因瞬时转染ECV304细胞株证明SPATAll基因能促进细胞周期的进 展，对细胞凋亡则无影响。 关键词：基因克隆，睾丸，功能研究，生物信息学，电子差异