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* * 微生物学实验技术 第一章 普通光学显微镜的使用 一、普通光学显微镜 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，由机械装置和光学系统两大部分组成 。 在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。 油镜：放大倍数最大，可达100x ，使用时需要在载玻片和镜头之间滴加镜油。 1）增加照明亮度 2）增加显微镜的分辨率 二、使用前准备： 1）光源调节 自带光源或自然光源 2）目镜调节 双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，左目镜上一般还配有屈光度调节环，可以适应眼距不同或双眼视力有差异的观察者。 3）聚光器调节 光圈、光源亮度、聚光器高度 三、显微观察 1）低倍镜观察： 个体较大的微生物如酵母菌的观察，也用来确定高倍镜的观察视野。 养成好的调焦习惯：侧面观察 2）高倍镜观察： 个体较小微生物的观察。适当调节光圈及视野亮度。 物镜同焦 3）油镜观察： 主要用来观察细菌。香柏油，光圈，照明 一般情况下，应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。 注意：切不可将高倍镜转动经过加有镜油的区域。 按照说明书对显微镜进行清洁保养。 第二章 细菌制片 一、涂片 取一块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于载玻片中央；用接种环无菌操作在营养琼脂斜面上挑取适量菌苔，将沾有菌苔的接种环置于载玻片上的蒸馏水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜。若用液体培养物涂片，可用接种环蘸取1－2环菌液直接涂于载玻片上 。 二、干燥 自然干燥、用电吹风干燥。 三、固定 涂菌面朝上，通过火焰2-3次。 四、镜检 第三章 细菌的革兰氏染色 微生物中的细菌，其细胞小而透明，用压滴片或悬滴片在光学显微镜下观察时，菌体和背景没有明显的明暗差，不易看清其形态，更难以识别它们的结构。因此，需要对菌体进行染色，借助于染料使菌体着色后颜色的反衬作用，可以十分清楚地观察到细菌的形状、基本结构（壁、膜、细胞质、核及内含物）及附属结构（荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等）。 革兰氏染色 1.制片 取活跃生长期菌种按常规方法涂片(不宜过厚)、干燥和固定。 2.初染 滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1min后倾去染液，水洗至流出水无色。 3.媒染 先用碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1 min，倾去碘液，水洗至流出水无色。 4.脱色 将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管加95%乙醇脱色(一般20-30 s)，当流出液无色时立即用水洗去乙醇。 5.复染 将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水晾干。 6.镜检 油镜观察。 革兰氏阴性菌： 细胞壁肽聚糖层较薄、交联度低，含有较多易被乙醇溶解的类脂质，所以用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。 *