AML1新伙伴基因的检测与其断裂位点的鉴定.pdfVIP

山西医科大学硕士学位论文 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR ）技术，灵敏度较好，是目前融合基因检测的主要方 ， 但由于融合基因断裂位点的多样性以及伙伴基因的复杂性，使得常规RT-PCR方 无 检测 到全部的易位类型，且难以检测到新的未知基因的断裂融合。 在导师带领下，根据大量已报道的融合基因， 析AML1 基因的断裂特点，建立了一 种快速检测AML1 断裂融合事件的新方 ，即B/C 比值 ，该方 已申请了国家专利。在 此方法上，我们筛选出21 例可能携带有AML1 伙伴基因的可疑病例。 对RNA 结构进行 析时，一般先通过RT-PCR 反应扩增目的区域，然后再对扩增出的 目的DNA 片段进行克隆、序列 析等，而一般的RT-PCR 反应很难得到全长的cDNA 片 段。RACE （Rapid Amplification of cDNA Ends ） 能有效解决这一问题。3 -RACE 能够通 过已知的cDNA 序列，扩增出cDNA 的3 末端的全长序列。因此，通过3 -RACE ，对 可疑病例进行检测，可以发现异常条带，测序后搜索Genebank 数据库， 析AML1 新的 伙伴基因。 进一步用PCR 方 验证新融合基因的表达及其断裂位点，并初步 析其在急性髓系白 血病中的表达情况。 新的断裂位点的发现有助于阐明断裂融合发生的分子机制。新的伙伴基因的发现有助 于解释白血病发生的异质性，并筛选出新的白血病发生相关基因，进而为寻找靶向药物及 实现个体化治疗奠定理论基础。 2 山西医科大学硕士学位论文 第一部分 AML1 新伙伴基因的检测及其断裂位点的鉴定 材料与方法 1. 材料 1.1 实验标本 实验病例来源于山西医科大学第二医院血液科确 的 AML 1/ETO 阴性急性髓系白血 病患者中 （M3 除外），通过B/C 比值 筛出的21 例可疑病例；正常对照骨髓标本来自我 院体检中心的健康志愿者并经其知情同意。 1.2 主要仪器设备 PCR 仪 （GeneAmp PCR system 9700 ，USA ） UVP 凝胶成像仪 （UVP 公司，USA） 紫外 光光度计 （Gene Company Limited 公司，USA） 离心机 （Epp endorf 公司，German ） DYY-III 型水平电泳槽 （NGS- 108 型，北京六一仪器厂） 稳压稳流电泳仪 （Bio-RAD PowerPAC7000 型，美国伯乐公司） 高压消毒锅 （山东新华医疗器械厂） -80 深低温冰箱 （Forma scientific ，USA ） 低温冰箱 4 及-20 1.3 主要试剂 Triszol （Takara 公司） 逆转录酶（M-MLV ） （Fermentas 公司，USA ） Taq 酶(#EP0404) （Fermentas 公司，USA） 10 反应缓冲液 （随Taq 酶附赠） MgCL2 （随Taq 酶附赠） 3 Full RACE 试剂盒(D314) （TaKaRa 公司） Gel Extraction Kit(D2500-0 1) （OMEGA 公司） LA 酶(DRR02AG) （TaKa