根癌农杆菌介导的植物基因遗传转化技术.pptVIP

三、转基因植物作为生物反应器 优点：安全、廉价、高效、规模化 1、转基因植物生产疫苗 1990年Curtiss等人利用转基因烟草表达链球菌表面蛋白抗原A，用该转基因烟草饲喂小鼠，能引起免疫反应。 植物表达系统生产疫苗的特点： ①成本低廉； ②免疫活性高； ③安全性好； ④易于贮存和运输； ⑤使用方便。 包括：稳定表达系统、暂态表达系统 2、转基因植物生产抗体 1989年Haiti获得分别表达抗体重链和轻链的转基因烟草植株，杂交后在杂种中获得了与抗原结合的抗体。 迄今，不同类型的完整抗体如IgG1、IgM、IgA、 Fab抗体、 IgG1/IgA嵌合抗体、单链抗体(scFv)和单域抗体(VH)等基因都先后转入烟草、拟南芥、伞藻和大豆等作物中，并得到表达。 3、转基因植物生产其他多肽类药物 1988年比利时PGS公司首次利用转基因烟草生产神经肽。 virD操纵子：诱导型，virD1~virD4基因。 VirD1(16kD)、VirD2(47kD)蛋白参与T-DNA加工形成T-链：首先VirD1与25bp边界序列亲和结合，使其松弛，然后使VirD2在特异位点剪切。VirD2与T-链的5’端共价结合，并核定位信号，将T-链复合体导向细胞核。 virE操纵子：诱导型，virE1、virE2基因。VirE2蛋白(60.5kD)是ssDNA结合蛋白，与T-链结合，参与T-链复合体形成，还具有核定位信号，引导T-链复合体进入植物细胞核。 virF操纵子：诱导型，virF基因。 VirF蛋白(23kD)参与T-链复合体的运输。 virH操纵子：诱导型，virH1、virH2基因。VirH蛋白功能是降解植物伤口细胞产生的杀菌物质。 virD操纵子：诱导型，virD1~virD4基因。 VirD1(16kD)、VirD2(47kD)蛋白参与T-DNA加工形成T-链：首先VirD1与25bp边界序列亲和结合，使其松弛，然后使VirD2在特异位点剪切。VirD2与T-链的5’端共价结合，并核定位信号，将T-链复合体导向细胞核。 virE操纵子：诱导型，virE1、virE2基因。VirE2蛋白(60.5kD)是ssDNA结合蛋白，与T-链结合，参与T-链复合体形成，还具有核定位信号，引导T-链复合体进入植物细胞核。 virF操纵子：诱导型，virF基因。 VirF蛋白(23kD)参与T-链复合体的运输。 virH操纵子：诱导型，virH1、virH2基因。VirH蛋白功能是降解植物伤口细胞产生的杀菌物质。 * * 2、T-DNA的结构与功能 边界序列：25bp，TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC 右边界序列是完全保守的，对T-DNA转移是必须的。 * * 蓝白斑筛选法 * 三、材料、试剂和器具 1、烟草、甘蓝无菌苗或田间生长的植株。 2、含目的基因的共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。 3、YEB液培养基。 4、抗菌素储备液(Kan, Cif, Rif, Amp)。 5、MS基本培养基。 6、MS分化培养基。 7、70％乙醇。 8、0.1%升汞。 四、操作步骤 1、取幼嫩健康的叶片，用蒸馏水冲洗一遍，70％乙醇洗45秒，0.1%升汞消毒6－8分钟，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分。 2、将无菌叶片剪成份0.5cm×0.5cm的小块，叶片近轴面向下，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上，预培养2－3天。 3、挑取一个单菌落根癌农杆菌，接种到20ml附加相应抗生素的YEB培养液中，在27℃恒温摇床上培养到OD值为0.6-0.8。取上述上培养物按1％－2％的比例，转入新鲜的无抗菌素的YEB培养液中，继续培养6小时，当OD值为0.2-0.5时即可用于转化。 4、在超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿，从培养液中取出预培养的外植体，放入菌液中泡1－5分钟。取出外植体在无菌滤纸上吸去附着的菌液。然后接种在愈伤组织诱导或分化培养基（烟草的培养基为MS附加IAA0.5mg/L, BA2.0mg/L）上，28℃暗培养2－4天。 5、将经过共培养的外植体转移到加有选择压的脱菌分化和愈伤组织诱导培养基上。在光照的条件下，25℃进行选择培养。 6、选择培养2－3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽，或者产生抗性愈伤组织。将这些抗性材料转移到相应继代选择培养基上，或者转入附加选择压的生长和分化培养基中，令其生长和诱导分化。 7、待不定芽长到1cm以上时，切下并插入含有选择压的生