基因克隆步骤完整版.doc

总提取 () 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将 加到离心管中待用 () 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置 ；打开离心机预冷 () 加 μ氯仿，振荡 ，室温放置 ，分层； () ，，离心 ； () 取上清，加 μ异丙醇，混匀，室温放置 ； () ，，离心 ； () 弃上清，加 乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用乙醇清洗 () ，，离心 ； () 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加 μ 水，－保存。 此操作中所用到的器皿均需经过灭活酶处理。提取的总需经电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。值为核酸的吸收值，值为蛋白的吸收值，值在间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸值能达到左右。浓度计算公式：总 浓度（μ）×稀释倍数×。 反转录第一链的合成 纯化以去除基因组，操作按公司的 ( )说明书进行。其体系为： μ × μ μ 补齐至μ 条件为：，； 纯化后，即可进行反转录。其体系为： × （ ） μ Ⅰ μ μ 上一步的反应液 μ 补齐至μ 操作条件为： () 放置 ； () ， ； () 保存。 按公司的 操作，，反应体系如下： μ 模板 μ 引物 ( μ) μ 引物 ( μ) μ μ 反应条件为：°预变性；°变性，°退火，°延伸，循环次；°延伸。 反应完毕，取μ反应产物进行琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用μ反应产物）。 基因克隆及测序 产物切胶回收 将产物用琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的片段。使用公司的 割胶回收试剂盒进行纯化，步骤如下： ()平衡吸附柱：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入μ平衡液，×离心 ，倒掉收集管中的废液，吸附柱重新套回收集管中； () 按 胶加入μ 溶液，置于中 左右，中途混匀几次，至胶完全融化； () 将样品倒入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），室温下×离心 ，倒掉收集管中的废液，吸附柱重新套回收集管中； ()向吸附柱中加入μ 漂洗液（加乙醇），室温下×离心 ，倒掉收集管中的废液，吸附柱重新套回收集管中； () 重复上一步骤； () 将吸附柱放入收集管中，室温下×离心 ，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干； () 将柱子套入一新的灭菌 离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加μ 洗脱缓冲液，室温放置分钟，×室温离心 ，收集到的洗脱液即为回收的纯化液； () 取μ的纯化液体进行琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液中含量。 目的片段与载体连接 () 胶回收产物与载体连接体系，参考公司载体的试剂盒说明书。在灭菌的 离心管中配制如下溶液（ μ）： 回收 μ μ μ () 反应分钟，所得产物保存于－冰箱备用。 连接产物转化 α () 将 μ连接产物加入到μ α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置 ； () 水浴热激转化 ，立即放回冰上，放置 ； () 每管加入 μ 培养基（室温放置）， 振荡培养 ，使菌体复苏并表达抗性基因； () 在含有（ μ）的选择性平板上加入 μ 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用膜封好； () 将培养皿正放，约 ，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养 。 转化子的筛选及鉴定 () 用无菌枪头挑取平板上个单菌落，分别接种到 液体培养基中（含 μ ），，振荡培养 ； () 用 μ菌液做模板，进行鉴定（ μ 体系），操作步骤同。阳性菌液由生物公司测序鉴定，余下的菌液保存备用； () 测序结果在数据库中进行比对分析。