亮氨酰-tRNA合成酶CP1结构域内的某个插入突变变种的分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

上海交通大学硕士学位论文 上海交通大学硕士学位论文 中文摘要 中文摘要 中 文 摘 要 蛋白质的生物合成是所有生命体中一个基本而又十分重要的过程 它的一 个关键步骤是氨基酸与对应 tRNA 分子的共价连接 这一反应是由氨基酰 - tRNA 合成酶(aminoacylt-RNA synthetase, 简称 aaRS)催化进行的 aaRS 催化 tRNA 的氨基酰化形成氨基酰-tRNA 从而使蛋白质生物合成构件的氨基酸与 mRNA 分子上的密码子间接但又严格地对应起来 aaRS 表现出高度的底物专 一性 对遗传信息的翻译忠实性是至关重要的 因为当 mRNA 翻译时 蛋白合 成中的信息传递只能依靠反密码子与 mRNA 之间的识别 除了 aaRS 以外目前 还没有发现其他机制能够识别 tRNA 是否被正确的氨基酸氨基酰化 除精氨酰 - 谷氨酰- 谷氨酰氨酰-tRNA 合成酶外 其余 17 种 aaRS 的氨酰化反应分为 两步完成 第一步是氨基酸的活化反应 氨基酸攻击 ATP 的?-磷酸基 产生活化 中间体 氨酰腺苷酸以及焦磷酸 第二步为 tRNA 的氨酰化反应 氨基酸部分被转 移到 tRNA 的 3?-端核糖上 产生氨酰-tRNA 和 AMP 1990 年法国科学家 G. Eriani 等人根据同源蛋白质顺序分析(sequence alignment) 酶的一级和晶体结构以及 氨基酰化部位的差别将 20 种 aaRS 分为两类 每一类包含 10 种酶 第一类 aaRS 有两段保守的顺序 HIGH 和 KMSKS 它的活性中心为 Rossmann 折叠 由两个?3?2 部分组成 中间由连接肽 1 connective peptide 1 简称 CP1 相连 第二类 aaRS 共享三个特征 motif 位于结构和功能的关键位置 AaRS 除了通 过与其底物的精确识别来保证合成的氨基酰-tRNA 的正确性以外 不少 aaRS 还通过水解错误产物进行编校 通过这种严格控制 使错误的氨基酸掺入蛋白 质的量降低到最小 亮氨酰-tRNA 合成酶LeuRS, EC 6.1.1.4属于第一类 aaRS 的 A 亚类 与 它在一个亚类的有缬氨酰 -tRNA 合成酶ValRS异亮氨酰 -tRNA 合成酶 IleRS 甲硫氨酰 -tRNA 合成酶 MetRS 和半胱氨酰 -tRNA 合成酶 CysRS其中 MetRS 和 CysRS 的 CP1 结构域较小 分别为 100 和 50 个氨基酸 残基 而其它三种 aaRS 都有较大的 CP1 结构域 约 250 275 个氨基酸残基 大 肠杆菌 LeuRS 是由 860 个氨基酸组成的单亚基酶 分子量为 97.3 kDa 根据第 一类 aaRS 中的 A 亚类的氨基酸同源序列和嗜热菌Thermus thermophilusLeuRS X-光晶体衍射数据分析 大肠杆菌 LeuRS 的 CP1 结构域含 126 至 418 位共 292 个 I PAGE PAGE IV III III 残基 通过在 CP1 结构域构建变种酶并对其性质进行研究 研究证明大肠杆菌的 CP1 结构域为一个多功能区 它间接地参与 了与 ATP 和 tRNA 接受茎的结合 同时与酶的编校功能密切相关 在研究 CP1 功能时 我们发现一个在 LeuRS 的 CP1 内 368-369 间插入 253-368 肽段的插入突变变种 LeuRS-C 可以与大肠杆菌温度 敏感菌 KL231 互补, 也能够在转化子粗抽液中测定到 LeuRS 的活力 由于插入的 片段含多个氨基酸 占氨基酸总数的 13 之多 对这一插入变种酶的性质研究成 为我们的兴趣所在 但是该变种酶在常规的纯化过程中十分不稳定 成为进一步 研究 CP1 功能的障碍 我们已发表的研究论文表明在 N-端接入 His 标签的天然 LeuRS 基本对酶活力无影响 基于这种考虑 本文在 LeuRS-C 基因的编码序列的 5’ 上游接入了 His 标签的编码序列 试图用 Ni-NTA 亲和层析柱一步纯化该插入变 种酶 研究它的性质 本文报道了该插入变种酶基因重组质粒的构建 酶的纯 化 酶的热稳定性 二级结构的组成和酶学动力学常数 令人惊奇的是该酶具有 全部的两步反应活力 氨基酰化反应中对三种底物的 kcat 与 Km 与 N-端接有 His 标 签的天然酶的相同 关键词 大肠杆菌 亮氨酰-tRNA 合成酶 插入变种 表达和纯化 CP1 ABSTRACT Protein biosynthesis is a crucial process for all organisms. The most important step is