蜡梅热激蛋白基因CpHSP1的分子特征、原核表达及其转录的实时荧光定量分析-园林植物与观赏园艺专业论文.docx

目录目 目录 目 录 liI 录 ． ． ．．i 摘 要 ．I Abstract ． ．．III 第l章文献综述 1 1．1热激蛋白 ．1 1．1．1热激蛋白研究的历史及现状 l 1．1．2热激蛋白的分类 2 1．2植物小热激蛋白 2 1．2．1植物小热激蛋白的种类及结构 2 1．2．2 smHSPs的功能 ．．3 1．2．3 smHSPs的表达调控 ．7 第2章引言 9 2．1研究背景和意义 ．9 2．2技术路线 10 第3章蜡梅热激蛋白基因CpHSPl的分子特征 11 3．1实验方法 1l 3．2结果与分析 11 3．2．1 CpHSPl克隆子的获得及其序列特征 11 3．2．2 CpHSPl编码蛋白特征分析 。11 第4章蜡梅热激蛋白基因CpHSPl的原核表达 ．．15 4．1实验材料 一 15 4．1．1蜡梅花cDNA文库 15 4．1．2菌株和载体 ．1 5 4．1．3购买的主要试剂 ．1 5 4．1．4自配的主要试剂 ．．15 4．1．4主要设备 ．17 4．2实验方法 1 7 4．2．1蜡梅CpHSPl基因原核表达载体的构建 。17 4．2．2目的蛋白的诱导表达 。21 4．2．3 SDS．PAGE凝胶电泳检测目的蛋白 ．．2l 4．2．4大肠杆菌细胞活力实验 ．．22 4．3结果与分析 ．23 4．3．1原核表达载体的构建 ．23 4．3．2目的蛋白的诱导表达 ．24 4．3．3异源表达CpHSPI提高了大肠杆菌在高温和低温下的生存能力 ．26 第5章蜡梅热激蛋白基因CpHSPl转录的实时荧光定量分析 一29 5．1实验材料 29 5．1．1植物材料及生长条件 ．．29 5．1．2主要试剂 ．29 5．1．3主要仪器设备与耗材 ．29 5．2实验方法 ．29 西南大学硕士学位论文5．2．1蜡梅组织的采集 西南大学硕士学位论文 5．2．1蜡梅组织的采集 ．29 5．2．2蜡梅不同时期花芽的采集 ．．29 5．2．3蜡梅的不同胁迫处理 ．30 5．2．4总RNA提取 一30 5．2．5 eDNA第一链合成 3 l 5．2．6 CpHSPl表达特性分析 ．3 1 5．3结果与分析 32 5．3．1总RNA提取 32 5．3．2 CpHSPI表达特性分析 。33 第6章讨论 39 6．1 CpHSPI的原核表达方面 ．39 6．2 CpHSPI表达的转录水平方面 ．39 第7章总结 4l 7．1结论 ．4 l 7．2特色 4l 7．3下一步工作计划 4l 参考文献 ．．43 致 谢 ．5l 在校期间发表论文和参与项目 ．53 摘要蜡梅热激蛋白基因CpHSPl的分子特征、原 摘要 蜡梅热激蛋白基因CpHSPl的分子特征、原 核表达及其转录的实时荧光定量分析 园林植物与观赏园艺专业硕士研究生 胡雨晴 指导教师 眭顺照副研究员 李名扬教授 摘 要 热激蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一类能被高温、低温激素高盐、 干旱以及机械损伤等多种胁迫环境条件诱导而合成的应激蛋白，此蛋白普遍存在 于各类生物中，根据分子量的大小可分为HSPlOOs、HSP90s、HSP70s、HSP60s、 smHSPs(small HSPs)五大类，其中以smHSPs最为常见。smHSPs是一类分子量为 15-42kDa的HSPs，其分子组成最重要的特点是C端含有一个高度保守的ACD (a．c巧stallm domain)结构。编码smHSPs的基因均位于细胞核内，分属于6大 类，其中2类定位于细胞质，即细胞质I类和细胞质II类smHSPs，其余4类分别存 在于叶绿体(chlorplastid，CP)、内质网(endoplasmic reticulum，ER)、线粒体 (mitochondria，Mr)以及过氧化物酶体(peroxisomes，Po)中。smHSPs在细胞内 发挥着分子伴侣的功能，参与新生肽链折叠、蛋白质的组装与转运，对植物抵抗、 适应胁迫环境以及生长发育起着重要作用。 本论文在实验室已经构建好的蜡梅花cDNA文库并进行EST分析的基础上， 通过随机克隆测序，得到了1个热激蛋白基因cDNA序列，将其命名为CpHSPl (GenBank登录号：HQ894379)。在借助生物信息学对该基因进行序列特征和进化分 析的基础上，构建了原核表达载体使其在大肠杆菌中实现了异源表达，并探讨了 其表达产物在体外极端温度下的相关活性；同时通过转录水平的表达分析，研究 了该基因的组织表达情况及其在非生物胁迫处理下的响应特征，主要取得了以下 结果： 1．CpHSPl的分子特征方面 CpHSPl cDNA全长790 bp，其中开放阅读框为477 bp，编码158个氨基酸。序 列结构分析显示：CpHSPl编码蛋白的C端具有小热激蛋白共