DNA的测序方法原理及其应用.pptVIP

西南大学生物技术专业 基因工程 * 2) 蛋白序列序列创建分子分析 * * DNA的测序方法、原理及其应用 * 一、DNA序列测定概述及其发展 即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 　　 其基本原理是DNA?的复制反应体系中需要存在DNA?聚合酶、DNA?模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成双链后，DNA?聚合酶在引物的引导下在模板链上沿3’→5’的方向移动，dNTP?按照碱基配对原则，逐个连接在引物的3’-OH?末端。 * 1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个 氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70 年代后期，Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序 列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和Maxam Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段， 使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样 人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序 列。 * 二、测序的常用方法 DNA序列测定常用方法有如下3种： 1、末端终止法 2、化学裂解法 3、DNA测序自动化 使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。 用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。 类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。 优点 简便、迅速、应用广泛。 不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。 1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速8-10h。 * 1）双脱氧链终止法测序(the chain termination method) 基本原理： 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。 * 用于终止反应的双脱氧核苷酸： 将2’ ，3’ –双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3’ –羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。 * O 碱基 C P O H 1 2 3 4 5 O 碱基 C P H H 1 2 3 4 5 H2O 脱氧核苷酸的连接 * O 碱基 C P H H 1 2 3 4 5 O 碱基 C P OH H 1 2 3 4 5 OH X 双脱氧核苷酸… ? * * 2）Maxam-Gilbert 化学降解法测序 基本原理： ① 用放射性核素标记待测DNA一侧末端 ② 将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 ③ 用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 ④ 电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列 * * 表特异断裂4种脱氧核苷酸的方法 作用的碱基 试剂与反应 碱基释放 DNA断裂 强G/弱A 稀释250倍硫酸二甲酯，在50mM卡可酸（PH8.0）10MMgCl2、0.1MEDTA20℃60分钟，DNAG的N7和A的N3甲基化 甲基化嘌呤不稳定，在中型PH加热被破坏 在0.1M碱中，90℃15分钟，戊糖脱落，DNA链断裂，G断裂比A快5倍 A 同上 0.2NHCl、0℃、60分钟，碱基被破坏 同上，A断裂比G快 C+T 15-18M联苯胺、20℃50分钟，嘧啶环被破坏释放 0.5M哌啶处理，断裂DNA键，C与T有同样速率 C 2MNaCl，联氨处理方法同上，100分钟，此时，T的破坏被抑制，只有C被破坏释放 同上，只在C处断裂DNA链 * 在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是： G反应硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 G+A反应（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。 T+C反应肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。 * ★ 碱基特异性修饰及裂解 反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂 断裂点 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡