凝胶过滤层析法分离血红蛋白.pptVIP

感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 凝胶过滤层析法分离血红蛋白 化学生物学实验 药学院 化学生物学教研室 * 感谢你的观看 2109年5月18日 1.实验目的 初步了解凝胶过滤层析法的简单原理及应用 初步掌握应用凝胶过滤法分离蛋白质 1 2 * 感谢你的观看 2109年5月18日 2.实验原理 层析法是利用混合物中各组分物理经学性质的差别（如吸附力、溶解度、分子形状、大小和极性等），使各组分以不同的程度分布在两相中，从而使各组分以不同的速度随流动相向前流动而达到分离的目的。层析法可分为多种类型，包括分配层析，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析等。 层析法 分配层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析 * 感谢你的观看 2109年5月18日 2.实验原理 1 待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相 由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同 与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时受到的阻滞作用小，移动速度快 分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的 2 3 4 * 感谢你的观看 2109年5月18日 凝胶过滤层析，主要根据混合物中分子的大小及形状不同，在通过凝胶（固定相）时，分子的扩散速率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性的网状结构，小分子可以进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速率慢（阻滞作用大）；而大分子则被排除在外，沿凝胶间空隙随（流动相）流动，流动短而移动速率快（阻滞作用小），比小分子物质先流出层析床，所以凝胶过滤层析又称为排阻层析，分子筛层析，凝胶过滤法操作简例，且操作条件温和，不易引起生物样品变性失活，分离效果好，故广泛应用于蛋白质、酶、核酸的分离提纯（包括脱盐、浓盐及分子量的测定等） 2.实验原理 * * 本实验通过sephadexG50层析柱，以蒸馏水为流动相，分离血红蛋白（红色，分子量约64,500）与二硝基氟苯-鱼精蛋白（鱼精蛋白与二硝基氟苯结合后为黄色，分子量为2,000-12,000）的混合物，从颜色的不同即可观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。 2.实验原理 * 感谢你的观看 2109年5月18日 3.实验用品 试剂 （1）交联葡聚糖G-50 （2）二硝基氟苯 （3）鱼精蛋白 （4）0.9%NaCl （5）10%碳酸氢钠 （6）95%乙醇 仪器 （1）锥形瓶 （2）层析柱（1cm×25cm的玻璃柱）（3）铁架台 （4）弹簧夹 （5）细橡皮管（长2cm）（6）量筒 （7）小烧杯100ml * * 4.操作步骤 1、凝胶准备：取sephadex G-50 3g置于锥形瓶中，加蒸馏水90ml，于沸水浴中煮沸2小时(或放于水中浸泡6小时)，充分膨胀凝胶。取出，冷却至室温后备用。 2、装柱：关闭下口，向玻璃柱内加入蒸馏水达柱总长度约1/3处，把膨胀好的糊状凝胶边搅拌、边自柱的顶端沿管内壁缓缓加入柱中至柱顶部，待柱底部凝胶沉积至1-2cm时，开启柱底部出水口，并控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。再慢慢地继续加入凝胶，直至凝胶体积至柱顶2.5cm左右，最好一次连续装完，若分次装入，需用玻璃棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面。装柱长度至少8cm。最后放入略小于层析柱内径的圆形小滤纸片，以防将来加样时凝胶被冲起。 * * 4.操作步骤 3、平衡：用10ml左右的蒸馏水流洗整个柱床。操作过程中严防出现气泡和分层，如床面不平，可用玻璃棒轻轻搅动表面，是凝胶重新自然沉降。整个过程中勿使液面低于床面，以免气体进入，使柱床干裂。 4、加样：待柱床面以下的蒸馏水流出，且刚好与床面相切时(切不可使床面完全暴露于空气中)，关闭下口。用滴管取血红蛋白及鱼精蛋白混合液（血红蛋白稀释液3滴加DNP-鱼精蛋白溶液3滴），十分小心地并缓缓沿内壁加入(注意切勿破坏柱床面)，打开柱底部出口，使样品进入床内，至床面重新露出时，先加入少量的蒸馏水，冲洗床面1-2次，然后再加入足量蒸馏水。 * * 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看 感谢你的观看