施氏假单胞菌JP1厌氣降解多环芳烃机制的研究-海洋生物学专业论文.docx

汕头大学博士学位论文 汕头大学博士学位论文 万方数据 万方数据 摘要 多环芳烃（PAHs）是持久性有机污染物（POPs）中的一种，对生物体具 有致癌、致突变、致畸等严重危害。人类活动和能源利用过程中产生的多环芳 烃通过污水排放、地面径流、大气沉降等途径进入海洋，最终的归宿是海底沉 积物，海底环境缺氧又极大的限制了其降解。课题组前期从汕头海域海底表层 沉积物分离得到的兼性厌氧菌施氏假单胞菌 JP1(Pseudomonas stutzeri JP1)，能 够在有氧和厌氧条件下降解多种多环芳烃。本文以菌株 JP1 为研究对象，研究 添加碳源、氮源、电子受体以及不同盐度和时间对菌株厌氧降解苯并(a)芘的影 响，通过 GC-MS 检测菌株降解 PAHs 的产物，通过基因组测序、转录学验证功 能，分析其厌氧降解苯并(a)芘的差异蛋白，探索菌株 JP1 厌氧降解苯并(a)芘等 高分子量多环芳烃的机制，为阐明其微生物厌氧降解机制奠定了坚实的基础。 研究结果表明：菌株 JP1 能够在厌氧环境中降解苯并(a)芘等多环芳烃。随 着时间的增加菌株对苯并(a)芘的厌氧降解率逐渐增加；在盐度 20‰ 时厌氧降 解率最高；二糖能促进菌株对苯并(a)芘的厌氧降解，而单糖则抑制降解；除了 L-天冬酰胺之外，其他几种氨基酸都能促进菌株厌氧降解苯并(a)芘；菌株 JP1 对菲的厌氧降解率高于对蒽的降解率，对芘、?、苯并蒽的厌氧降解率则无明 显差异；添加亚硫酸钠、氧化铁、氯酸钾对菌株 JP1 厌氧降解苯并(a)芘有明显 促进作用，硫代硫酸钠、高氯酸钾、碳酸氢钠对菌株 JP1 厌氧降解苯并(a)芘反 而有抑制作用。 菌株 Pseudomonas stutzeri JP1 在厌氧环境中能够将苯并(a)芘降解为 1,2-二 甲基苯并蒽、7,8,9,10-四氢苯并(a)芘、5-乙基?三者中的一种或多种，?或/和 苯并蒽，另外还产生大量的支链烃类。菌株 JP1 厌氧降解芘生成 4,5-二甲基菲， 4-甲基菲，菲。菌株 JP1 厌氧代谢苯并蒽的产物有 2,3-二甲基菲，2-甲基菲，以 及 2-甲基蒽/1-甲基蒽中的一种或两种。菌株 JP1 厌氧降解?的产物有 α-甲基二 苯乙烯，1-乙基-2-甲基菲，2-甲基菲，1-甲基菲。菌株 JP1 厌氧降解菲生成 1,2,3,4-四氢化-4-甲基-4-菲酚或/和 α-甲基二苯乙烯。菌株 JP1 厌氧代谢蒽生成 9,10-蒽醌或/和 1-蒽醌羧酸。菌株 JP1 在有氧环境中能够将苯并(a)芘降解为 1,2- I 二甲基苯并蒽、7,8,9,10-四氢苯并(a)芘、5-乙基?三者中的一种或多种，以及 1,6-二乙基-4 异丙基萘，另外也产生大量的支链烃类。 全基因组测序结果表明：菌株 JP1 基因组全长 3.59 Mb，含有 4533 个基因。 其中的一些基因组成了几个基因簇，包括：一个有氧降解芳烃的基因簇，两个 厌氧降解芳烃的基因簇，三个硝酸盐还原相关基因的基因簇，并对基因簇中的 一些代表性基因通过实时荧光定量 PCR 进行了转录表达功能验证，其中一些基 因参与厌氧降解苯并(a)芘。在菌株 JP1 中已发现有 43 个芳烃厌氧降解中心途径 苯甲酰 CoA 连接酶途径的基因，另外还有一些降解其他芳烃途径的基因。 菌株 JP1 不含质粒，因此推测其全部基因位于染色体中。对菌株厌氧降解 苯并(a)芘的差异蛋白质谱分析，得到一个参与外来污染物生物降解和代谢以及 糖酵解/糖异生的醇脱氢酶(6 - 羟基环己-1 - 烯-1 - 羰基酰-CoA 脱氢酶)，对其进 行实时荧光定量 PCR 分析进一步证实了其参与多环芳烃的厌氧代谢。 对菌株 JP1 在四种培养条件（LB 培养基中有氧培养（ae_LB），LB 培养基 中厌氧培养(an_LB)，含苯并(a)芘的无机盐培养基中有氧培养（ae_BaP），含苯 并(a)芘的无机盐培养基中厌氧培养（an_BaP））下进行转录组分析。ae_BaP 中， 外显子和基因间隔区域分别占 37.3%和 62.7%；ae_LB 中，外显子和基因间隔区 域分别占 65.7%和 34.3%；an_BaP 中，外显子和基因间隔区域分别占 32.4%和 67.6%；an_LB 中，外显子和基因间隔区域分别占 60.0%和 40.0%。分别对 ae_BaP vs ae_LB；an_BaP vs ae_BaP；an_BaP vs an_LB；an_LB vs ae_LB 的差 异表达基因进行分析以及 GO 富集分析和 KEGG 富集分析，并进行 SNP、InDel、 基因结构、UTR、sRNA 分析，以及新转录本和反义转录本预测。转录组学信 息进步一步完善和补充了对菌株 JP1 中的基因参与厌氧降解苯并(a)芘的认识。 关键词：施氏