联合应用RNAi技术和基因芯片技术研究K562细胞中c-myc基因的功能-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

————壁笙茎壁垒壁旦!竺型垫查塑苎里苎苎垫查里窒!!坚塑堕生!竺!!苎里塑塑墼联合应用Pd,,fAi技术和基因芯片技术研究 ————壁笙茎壁垒壁旦!竺型垫查塑苎里苎苎垫查里窒!!坚塑堕生!竺!!苎里塑塑墼 联合应用Pd,,fAi技术和基因芯片技术研究 K562细胞中c．myc基因的功能 硕士研究生： 岳枫 指导教师： 马文丽教授 郑文岭教授 摘要 K562细胞是由Lazzio从一位慢粒急变病人的胸水中培养建株的人红白血 病细胞，恶性程度较高。自血病的发生是个多因素、多环节、多步骤的渐进过 程，涉及许多与细胞生长、分化功能相关的纂因变化。当癌细胞受到内外环境 改变的影响时，一些癌相关基因(原癌基因、癌基因、抑癌基因)以及细胞凋 亡分化相关基因会异常表达，从而使肿瘤细胞出现凋亡的特征性变化，如出现 核固缩、碎裂、胞浆中有大量空泡、凋亡小体等典型的形态变化特征。 c-myc原癌基因是MYC基因家族的一员，为“快速早期反应”的细胞内信 使，是双向调控基因，有促进细胞增殖和诱导细胞凋亡的双重作用。在接受造血生 长因子刺激时则促进细胞增殖；在缺乏造血生长因子或受到促细胞凋亡诱导剂 作用时，c．myc介导细胞凋亡。c．myc基因表达失调是细胞凋亡的主要诱因，属 于细胞凋亡调控基因中的诱导基因。有文献报道，e-myc基因表达水平的调节 与白血病细胞的分化增殖有密切关系。白血病病人c-myc基因表达过高则预后 不良。 中文摘要RNAi即RNA干扰，是生物界～种古老而且进化上高度保守的现象，是基 中文摘要 RNAi即RNA干扰，是生物界～种古老而且进化上高度保守的现象，是基 I司转录后沉默作用(PTGS)的重要机制之一。RNAi主要通过dsRNA被核酸酶 切割成21-25nt干扰性小RNA即siRNA，由siRNA介导识别并靶向切割同源性 靶mRNA分子而实现。RNAi技术是近年来发展起来的特异性高效抑制基因表 达的方法，在后基因组时代的基因功能研究中有广阔的应用前景。 本研究中为了研究c．myc基因的功能，首先应用RNAi技术，在线设计针对 c．myc基因mRNA三个靶位点(715、1357、1574位点)的siRNAs来干扰K562 细胞中该基因的表达。通过比较RT-PCR和流式细胞仪检测结果，筛选出针对 第1574靶位点的siRNAs干扰效果最好。用这对siRNAs转染K562细胞，通过 RT-PCR检测，观察到e-myc mRNA水平的表达有明显降低；通过漉式细胞仪和 MTT、苏木素．伊红检测，观察到细胞有一定的凋亡发生。说明在10％胎牛m清 培养条件下，通过RNAi技术有效的抑制c-myc基因的表达，可诱导K562细胞 凋亡。为下一步用芯片研究c．myc的功能奠定了基础。 同时，本研究应用基因芯片技术，分别提取转染前后K562细胞的总RNA， 将两组等量的总RNA反转录成双链eDNA后，应用限制性荧光标记技术(RD 技术)进行扩增标记，Cy3／Cy5荧光染料分别标记对照组，处理组eDNA，荧光 标记的样品与已制各的K562表达谱芯片杂交后，扫描、分析两组荧光信号的 强度和比值。实验结果表明，转染后的K562细胞共有455个基因表达呈下调 趋势(Cy5／cy30．5)，包括细胞生长调控因子、转录调节因子等；有12个基因 表达呈上调趋势(Cy5／Cy32，O)，包括凋亡相关基因、细胞代谢相关基因、细胞周 期相关基因等。这些结果表明e-myc基因诱导细胞凋亡的机制是非常复杂的， 与其促进细胞增殖的途径是互相交叉、相互重叠的，而不是完全独立的。 综上所述，本研究利用RNAi技术结合基因芯片高通量、快速、敏感的特 II 硕士论文 硕士论文 联合应用RNAi技术和基因芯片技术研究K562细胞中c-myc基因的功能 点对干扰后的K562细胞基因表达变化进行了初步的研究，为阐明肿瘤细胞凋 亡的分子机制提供了有意义的理论基础，并可为临床癌症治疗提供基因水平的 参考，为白血病的治疗提出新的思路。 关键词 K562细胞RNAi技术c-myc基因 限制性显示技术 cDNA表达谱芯片 111 ————!垡型L燮旦!!型鎏查塑墨里堇苎垫查里窒堕竺塑堕虫!=竺!!墨里塑塑堂Combining ————!垡型L燮旦!!型鎏查塑墨里堇苎垫查里窒堕竺塑堕虫!=竺!!墨里塑塑堂 Combining RNAi technology with DNA microarray to study the function of c—myc in K562 cells Name： Yue Feng Supervisor：Prof．Ma Wenli Prof．Zheng Wenling K562 cell is a highly malignant human erythro