原位杂交组织化学汇总.pptVIP

2 探针的标记与应用 切口平移法（Nick translation） 随机引物法 (Random Primer) 末端标记法 PCR标记法 体外转录标记法 不同模板需不同标记方法 生物素标记cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用 1 光敏生物素标记cRNA探针的应用 2 酶促生物素标记cRNA探针的应用 1 光敏生物素标记cRNA探针的应用 光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照10～20min，生物素就结合在DNA或RNA分子上，属于化学修饰法，此方法简单；成本低；适用于大量制备（50ug）。 光敏生物素试剂种类： 光生物素（乙酸盐） 补骨脂素生物素。 生物素-聚乙二醇-当归素（BPA）：在长波UV下它可与DNA碱基共价键结合。BPA反应物与DNA结合比光敏生物素更特异，在可见光下它不与核酸反应，这个特异性可使BPA只标记粗制细胞裂解物中的核酸，而不标记蛋白、多糖和其他细胞大分子。 光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序如下：　 １ 石蜡切片脱蜡入水后，PBS洗；冰冻切片直接入PBS洗。 ２ 0.1mol/L甘氨酸PBS洗5min。 ３ 0.4%Trixtion X-100 PBS洗15min。 ４ 1ug/ml蛋白酶K，37℃保温30min。 ５ 4%多聚甲醛PBS固定。 ６ 0.1mol/L PBS洗2×3min。 ７ 0.25%乙酸酐10min。 ８ 2×SSC洗10min。 ９ 取10ul含相应探针的杂交液滴于标本上，如果是cDNA探 针，则用前将探针于95℃水浴中保温10min，马上冰浴冷 却，然后再用。 10 盖上硅化盖玻片或蜡膜，43℃湿盒保温12—16h。 11 4×SSC洗脱盖片，并在同一液中，37℃漂洗10-30min。 12 2×SSC（含20ug/mlRNaesA，适于RNA探针）37℃洗30min。 13 1×SSC，0.1×SSC，37℃各漂洗10-30min。 14 0.05mol/L PBS洗4×5min。 15 3%BSA（0.4%Triton X-100 PBS配）37℃保温30min。 16 碱性磷酸酶室温1~3h。 17 0.05mol/L PBS洗4×5min。 18 缓冲液Ⅰ洗2×5min。 19 缓冲液Ⅱ洗2×5min。 20 NBT/BCIP液显色，室温，暗处3h。 21 20mmol/L EDTA，pH8.0终止显色。 22 甘油明胶直接封片。 2 酶促生物素标记cRNA探针的应用 原理： 酶促生物素标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加 尾法等把修饰的核苷酸掺入到探针DNA 中，制成标记探针， 敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。 反应步骤如下： ① 用PBS冲洗黏附有切片的载玻片。 ② 将载玻片浸入0.3%H2O2，以封闭内源性过氧化物酶。 ③ PBS洗2×3min，加入抗生物素血清和正常山羊血清，室温1h或4℃过夜。 ④ PBS洗2×3min。 ⑤ 加生物素化室温30min孵育。 ⑥ PBS洗2×3min。 ⑦ 应用ABC复合物与等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合，室 温孵育1h。 ⑧ PBS洗2×3min。 ⑨ DAB溶液孵育3-15min。 ⑩ 水洗，复染，脱水，透明和以甘油/PBS或DPX封固。 地高辛标记cRNA探针的应用 地高辛标记cRNA探针的应用 原理： 地高辛（Dig）为类固醇半抗原，仅存在于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物无交叉反应，地高辛标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成Dig-11-dUTP。通过随即引物或缺口平移法，将Dig-11-dUTP与探针的核酸分子相连，构成Dig-配基标记的核酸探针。 将这种标记的探针与组织、细胞或染色体原位核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交，然后用偶联有酶或荧光素的抗地高辛抗体结合物作为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的。 常用的免疫酶学检测方法： Dig-HRP检测系统： 以DAB/H2O2为底物，结果为棕色； 以4-氯-1-萘酚/ H2O2为底物，结果为蓝色。 Dig-AKP检测系统： 以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。 AKP灵敏度和分辨率较HRP高，但HRP的优点为廉价、稳定。 地高辛标记的核酸探针较稳定，-20℃储存可达2年，随时可以 取用，但在现实应用中，人们仍采用新鲜的地高辛标记3-6个 月以内的核酸探针。为节省核酸探针的用量，凡使用过的含有 探针的杂交液也可反复多次使用。 地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受 半衰期限制，探针可长期保存。与生物素标记探针相比，地高 辛探针不受