重组DNA技术和基因工程.pptVIP

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化学合成法的基本战略 全基因合成 化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知,有三种战略: 小片段粘接法: 混合退火 根据目的基因全序列,分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段。 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 补钉延长法: 混合退火 根据目的基因两条互补链全序列,分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段。 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 化学合成法的基本战略 全基因合成 大片段酶促法: 混合退火 根据目的基因的全序列,分别合成40-50碱基长的单链DNA片段。 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 化学合成法的基本战略 全基因合成 或RCR扩增 上述三种方法各有利弊:化学合成DNA的单片段愈短,收率就愈高,但由于化学合成的份额较大,成本较高;在大片段酶促法合成目的基因时,虽然化学合成的份额相对较小,成本较低,但大片段化学合成的收率极低,例如,每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%。 化学合成法的基本战略 全基因合成 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下,往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列 而基因序列未知,此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的DNA 序列,然后合成探针,筛选由鸟枪法或cDNA法得到的重组子,最终 获得含有目的基因的目的重组子。由于大多数氨基酸拥有简并密码子 故在探针序列的设计时必须考虑下列问题: 生物体对简并密码子的偏爱性,合成系列探针 探针应具有足够的长度,通常在17-20个核苷酸之间 探针内部不应出现可能的互补区域 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 某段连续的氨基酸序列: Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile 所有可能的DNA序列: TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC 设计的简并探针序列: TGTATGGACGAIATGA TGTATGGATGAIATGA TGCATGGACGAIATGA TGCATGGATGAIATGA A G 此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计。 expressed sequence tag 化学合成的单元操作 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去,每接一个单体就是一个循环反应,包括:基团保护、分离、缩 从反应机理上来讲,DNA化学合成方式有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法;具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐,基本上已淘汰;后者反应中间物的分离程序较简 合、分离、去保护五大操作单元。 便,DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的。 化学合成的单元操作 O H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me Me H DMT: 二甲氧基三苯甲基 激活 缩合 氧化 脱取代基 玻璃珠 连接臂 DNA化学合成的用途 合成天然基因 修饰改造基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素 如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等。 基因等。 E 基因文库的构建 4 目的基因的克隆与基因文库的构建 基因文库的基本概念 基因文库的构建程序 基因组文库重组克隆的排序 基因文库的基本概念 基因库与基因文库 基因库(gene pool) 特定生物体全基因组的集合(天然存在)。 基因文库(gene library or gene bank) 从特定生物个体中分离的全部基因,这些基因以克隆的形式 基因组文库(含有全部基因) 存在(人工构建)。根据构建方法的不同,基因文库分为: cDNA文库(含有全部蛋白质编码的结构基因) 基因文库的基本概念 基因文库构建的基本战略 用鸟枪法构建基因组文库,材料来自染色体DNA。 用cDNA法构建cDNA文库,材料来自mRNA。 在高度分化的生物体中,不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同(即基因的表达谱不同),因此同种生物体的cDNA文库 一般还有组织细胞的界定,如肝组织

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