第12章体外培养细胞转化.pptVIP

第12章 体外培养细胞的转化 体外培养的细胞，有时会发生自发转化，但这种自发产生的转化时间长，转化率极低，需用大量细胞，必须用人工诱发的方法。 人工诱发体外培养细胞转化，转化细胞所需时间短，转化率较高，这对研究癌变原理，研究可疑致癌因素的作用有很大的实用价值。 第一节 基本概念和原理 本节内容: 一、细胞转化的基本概念 二、细胞转化与恶变的区别 三、细胞转化的方式 四、细胞转化的基本过程 一、细胞转化的基本概念 细胞转化是细胞发生遗传性改变而导致细胞永生化的转变方式，由限定性细胞系转变成连续性传代细胞系，获得了永生化。 二、细胞转化与恶变的区别 转化：只是遗传特性、生长特性、生物学性状改变，但无致瘤性 恶变：是细胞癌性变，有致瘤性 三、细胞转化的方式 １．细胞自发转化：体外培养的细胞在无任何诱变剂存在的条件下，细胞自发出现的转化现象。 ２．人工诱发转化(人工诱变)：在体外培养的细胞中，常因化学、物理和生物等各种致癌因素的影响，而使细胞发生转化，转化周期大大缩短 ，转化率高。 四、细胞转化的基本过程 １.诱发(Initiation)阶段 诱变剂直接接触细胞 （6小时以上最高不超过24小时），诱变剂种类多如： 物理因素：如放射线、温度、电磁波、药物等 化学因素：如甲基胆蒽、土醌80、7.12—二甲基苯醌(DMBA)、3-甲基胆蒽、甲基甲磺醌(MMS)、乙基甲磺酸(EMS)、乙基亚硝基脲(ENC)、甲基硝基亚硝基胍类化合物等； 生物因素，如毒素、黄曲霉素、病毒SV40、EB病毒、多发瘤病毒(Polioma)、逆转病毒等 促癌剂(Promotor) ：如TPA ２.DNA的损伤与修复阶段 修复过程中发生修复错误，引起DNA结构的改变，细胞发生了遗传性改变。 ３.“转化灶”的产生 进入转化发展阶段的细胞仅是一小部分(大约5%左右)，这些细胞称为癌前细胞(Precancerous Cell)，均散在未受损伤的细胞中，随着细胞的继续培养，那些未受损伤的正常细胞由于接触抑制的限制而停止运动，细胞分裂消失，但那些散在的癌前细胞由于失去了接触抑制，加上生长繁殖速度变快，而进行持续不断的分裂增殖，由于在局部癌前细胞的数量增多而堆积，呈厚厚的多层排列，最后形成了明显可见的“转化灶”(Focus)，常见有灰白细胞堆积中心点和放射排列的灶（见书后照片） 第二节 诱变因素的选择 本节内容: 一、诱变剂的选择 二、细胞的选择 三、目前常用的细胞种类 一、诱变剂的选择 要根据体外培养的细胞而定，这可能与细胞对某种诱变剂的敏感及其特异受体的存在有关，因此，实验时要根据细胞特性来选择合适的诱变剂。 人胃上皮细胞 适宜用SV40病毒转化； 人淋巴细胞 适宜用EB病毒转化； 地鼠肾细胞 适宜用多发病病毒(Polioma)转化； C3H小鼠胚纤维细胞 适宜化学致癌物转化。 二、细胞的选择 选用细胞的原则为： （1）、体外容易培养和传代，克隆形成率高，并能建立细胞系。 （2）、细胞本身无自发转化能力，动物致癌试验阴性。 （3）、体外传代细胞系最好选用已失去二倍体核型，已获无限生长能力，但仍保持接触抑制而无致瘤性的细胞系。 三、目前常用的细胞种类 (一)原代细胞：动物细胞以叙利亚幼地鼠和金黄色地鼠胚胎纤维细胞或幼地鼠肾细胞为佳 ；人源细胞取自胚胎、小儿包皮及成人真皮纤维细胞和淋巴细胞等 。 (二)传代细胞系 1、C3H/10T1/2(ATCC、CCL、NO226) 2、3T3-Swiss albsho(ATCC CCL NO92) 3、BALB/3T3(ATCC CCL NO163)等 4、BHK21(ATCC CCL NO10) 5、NIH/3T3-Swiss Mouse(ATCC、CRL、NO1658)； 6、Rat-1； 7、PC-12（ATCC、CRL、NO1721）； 8、CHO细胞系；9、V79细胞系 第三节 细胞的转化和转化灶的分离纯化 本节内容: 一、细胞的转化 二、转化灶的分离 三、转化细胞的筛选 一、细胞的转化  二、转化灶的分离 1、刮除法(1)先在有转化灶的瓶壁上用记号笔圈出记号，倒掉培养基。 (2)再用胶皮刮(或用加热的微型电烙器具)在倒置显微镜下去除未发生转化的圈外正常细胞。 (3)向瓶内加入PBS洗去刮下的细胞，再用0.25％胰蛋白酶(或0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA1:1混合)置室温消化。 (4)待被消化的细胞略有松动时，翻转瓶底，继续消化，至细胞松散时，弃去消化液，加入新鲜的10%小牛血清的培养基，中止消化，并反复用吸管吹打分散，制成细胞悬液，分瓶培养。 (5)成单