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第四章 细胞培养用液及培养基;4.1 培养用液;培养用水;;其他细胞培养用液;配制： 配制溶液应使用双蒸水或去离子水。 如果配方中含有Ca2+、Mg2+，应当首先溶解这些成分。 一般加有少量的酚红作为溶液酸碱度的指示剂，以便观察培养液pH的变化。溶液变酸时呈黄色，变碱时呈紫红色，中性时呈桃红色。 配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。;消化液 取材进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来。 常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA 溶液，有时也用胶原酶（collagenase）溶液。可分别单独使用或混合使用。;1.胰酶溶液 胰蛋白酶是从动物胰脏分离的一种水解酶，作用是使细胞间的蛋白质水解（作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健）从而使细胞离散。 不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用时应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。;胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常见有1：125 和1：250，即一份胰酶可消化125 或250 份酪蛋白。 因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。 组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%浓度，pH 7.2左右。过滤除菌，分装，于-20℃保存以备使用。 终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。;2.EDTA 溶液 EDTA是一种化学螯合剂，能螯合Ca2+、Mg2+，破坏细胞间的连接，使细胞分离，对细胞毒性小。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA 和胰酶的混合液进行消化。 EDTA 溶液的使用浓度为0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。 EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。 ;3.胶原酶溶液 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对上皮细胞产生损伤。 胶原酶的使用浓度为0.1-0.3mg/L 或200U/mL ，作用的最佳pH 为6.5。 胶原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制。过滤除菌，分装，-20℃保存。 ;;pH 调整液 常用的有HEPES 液和NaHCO3 溶液。 1.NaHCO3 溶液：NaHCO3 是培养基中必须添加的成分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保证培养基在5%CO2 的环境下pH 达到设计标准。此时常用5.6%或7.4%的NaHCO3 溶液调节培养基，使之达到所要求的pH 环境。;2.HEPES 溶液：是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性，主要作用是防止培养基pH 迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2 的环境，CO2 气体迅速逸出，pH 迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0 左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。;抗生素 常用的是青链霉素，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。 通常使用青霉素终浓度7-8mg/100ml,链霉素终浓度10mg/100ml。一般配制成100 倍浓缩液，可用PBS 或培养基配制。;谷氨酰胺补充液 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7 天即可分解约50%，所以都是在使用前添加。配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2 周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内。 谷氨酰胺使用终浓度为2mmol/L。一般配制为100 倍浓缩液，即浓度为200mmol/L（29.22g/L），配制时应加温30℃，完全溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于－20℃。使用时，在每100ml 培养液中加入0.5~2ml 谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1~4mmol/L。;二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺） 在细胞培养液中L-谷氨酰胺是大部分细胞培养基的基本成分；而L-谷氨酰胺是一种并不稳定的氨基酸，在中性的水溶液中会自发降解；需要频繁地补加L-谷氨酰胺。因而在培养操作过程中经常：（1）频繁打开盖子，增加了破坏无菌状态的可能性；（2）过多的追加L-谷氨酰胺，增加了培养基中氨的毒性水平。 二肽谷氨酰胺在细胞培养中稳定而不降解,可高压灭菌,释放毒性氨最少。二肽谷氨酰胺在细胞内被氨肽酶（E.C.3.4.11.2）所水解，产生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分细胞系统中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺