离子交换层析法.PPT

歐亞書局 CH 3 胺基酸、胜肽與蛋白質 歐亞書局 3.3 蛋白質的操作與分析 p.87 蛋白質可分離與純化 在一種蛋白質的性質與活性能明確決定前，製備出高純度的蛋白質是絕對必須的。蛋白質的來源一般是組織或微生物細胞。 蛋白質純化的第一步驟就是將這些細胞打破，使其蛋白質釋出至溶液中，此部分即稱為粗萃取物（crudeextract）。 一般粗萃取物會先以基於蛋白質大小或電荷差異為基礎的處理方法加以分離，稱為分劃（fractions）或分部分離（fractionation）。 透析（dialysis）就是一種利用蛋白質大分子性質而將之交換溶劑的方法。 功能最強大的分劃方法是管柱層析法（columnchromatography）。它是利用蛋白質之大小、電荷、結合能力與其他性質之差異加以分離（圖 3-16）。 離子交換層析法（ion-exchange chromatography）是利用在特定的 pH 值下，蛋白質淨電荷之正負與帶電量的差異來進行純化。 管柱基質是一個具有帶電基團的合成聚合物（樹酯）；帶陰離子的基團稱為陽離子交換劑（cation exchangers），而帶陽離子的基團稱陰離子交換劑（anion exchangers）。 p.88 圖 3-16 p.88 圖 3-16(續) p.88 圖3-16　管柱層析法。標準的層析管柱元件包含底部的一個固相多孔狀墊片（基質)，材質大多為塑膠或玻璃，讓溶液（為移動相）可以流通過基質（為固定相）。管柱底部之流出液會不斷被上方儲液槽中加入的緩衝溶液取代。待分離的蛋白質樣品混合溶液亦由上方置入管柱中，待其完全沒入固定相後再繼續補充緩衝液。隨著蛋白質混合液在管柱中移動，各種不同蛋白質會與固定相基質間產生程度不同的交互作用。隨著蛋白質樣品往管柱底部移動，各種蛋白質色帶（如圖蛋白質 A 為藍色、B 為紅色、C 為綠色）會逐漸加寬，進而達到分離之目的。增加管柱長度將提高分離效果（即解析度增加）；但相對地隨著層析時間的增加，蛋白質色帶隨擴散作用也會持續加寬，此現象則會降低解析度。以圖中為例，蛋白質 A 可完全與 B 和 C 分離，但 B 與 C 之間則因擴散現象而無法達到完全分離的效果。 在陽離子交換管柱層析法（cation-exchange chromatography）中（圖3-17a），固相基質是帶負電荷基團。 大小-排除層析法（size-exclusion chromatography），也稱為膠體過濾法（gel filtration，圖 3-17b），是利用蛋白質大小之差異進行分離。 親和性層析法（affinity chromatography）則利用蛋白質結合親和力之差異加以分離（圖 3-17c）。 p.90 圖 3-17(a) p.89 圖3-17　蛋白質純化常用的三種管柱層析方法。(a) 離子交換層析法是利用蛋白質在特定 pH 值時之靜電荷差異進行分離。 圖 3-17(b) p.89 圖3-17　蛋白質純化常用的三種管柱層析方法。 。(b) 大小-排除層析法（也稱為膠體過濾法或是分子篩過濾法）是利用蛋白質大小之差異進行分離。 圖 3-17(c) p.89 圖3-17　蛋白質純化常用的三種管柱層析方法。 (c) 親和性層析法是利用蛋白質與固定相基質上連接之特殊配位基間結合專一性能力之差異進行分離。在內文中將對此方法做進一步詳細介紹。 最新改良的層析法是高效能液相層析法（highperformance liquid chromatography；HPLC）。此方法利用高壓幫浦，搭配填充可抵抗高壓流動下造成之碎裂力的高品質層析介質，以提高蛋白質分子在管柱中移動的速度。 隨著每個純化步驟的完成，蛋白質樣品含量與體積通常會隨之減少（表 3-5），此時較適合以更複雜（且較昂貴）的管柱層析法加以分離。 p.90 表 3-5 p.91 範例 3-1 胜肽的離子交換 一位生物化學家想要利用離子交換管柱層析法分離兩條 胜肽。在這支管柱移動相的 pH 值下，胜肽（A）的淨 電荷為 －3，這是因為其含有的 Glu 與 Asp 殘基比 Arg Lys 及 His 殘基多；而另一條胜肽（B）的淨電荷則為 ＋1。請問哪一條胜肽在陽離子基質中先被沖提下來；而 哪一條胜肽則是在陰離子基質中先被沖提下來？ p.90 範例 3-1(續) 解： 在陽離子基質中帶有負電荷會與陽離子分子結合，進而 阻滯陽離子分子在管柱中的行進。而帶有正淨電荷的胜 肽（B）和胜肽（A）相比會與陽離子基質有較強的作用 ，因此，在陽離子交換管柱中胜肽（A）將會先被沖提下 來。相對的，在陰離子交換管柱中胜肽（B）會先被沖提 下來，因為帶有負淨電荷的胜肽