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第四章、免疫组织化学技术 Immunohistochemistry 吉林大学白求恩医学院 组织胚胎学系 李树蕾 2012-11-6 概念： 应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些多肽和蛋白质等大分子物质进行原位定性、定位或定量研究的技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。 基本过程： 被检抗原/半抗原提取→免疫动物→特异性抗体→标记抗体→抗原抗体反应部位出现有色沉淀 免疫酶组织化学 免疫荧光组织化学 免疫胶体金组织化学 亲和免疫组织化学 （抗原信号放大系统） 优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。 第一节 免疫组织化学基本原理 一、直接法 用酶或其它标记物标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原结合，再与酶的底物作用产生有色产物沉积，在抗原抗体反应的部位即可检测。 优点：简单快速，特异性强，非特异性反应低； 缺点：敏感性差；抗原量要求高；很难获得各种市售标记抗体。（肿瘤蛋白标记物：低丰度蛋白） 第一抗体（兔）不标记，使用与一抗种属相同抗体的Fc段（有种属特异性）作为抗原免疫动物（羊），制备抗抗体，即第二抗体（羊抗兔），并标记第二抗体。 优点：间接法因第二抗体的放大作用敏感性大大增高（放大原理=抗原：抗体1：6）； 缺点：可能出现非特异性反应； 三、亲和免疫组织化学 (一)亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法 (avidin-biotin-peroxidase complex method，ABC法) 特点: 以亲和素作为“桥”将生物素结合的酶和生物素化的抗体连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增加敏感性。 1.原理: 生物素 (biotin)为含硫的杂环单羧酸，生物素分子量为244.31，pI为3.5，咪唑酮环（又称Ureido环）(I环)是与亲合素结合的主要部位；Ⅱ环为噻吩环有一个戊酸侧链，末端羧基是标记抗体和酶的唯一结构。 亲和素 (avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白，分子量为6.8KD，pI 10～10.5；在pH9～13缓冲液中性质均稳定。天然亲合素为碱性蛋白，由4个相同的亚单位构成4聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与生物素中的Ureido环（I环）结合。因此，1个亲合素分子存在4个与生物素分子结合位点 ABC法 2. 免疫组织化学酶类标记物 免疫组化标记物的酶以共价键结合在抗体上，SABC法则采用生物素-亲和素系统，制成酶标抗体，再借助酶对底物的特异催化作用，生成有色不溶沉淀，在光镜下进行各种抗原成分观察 。 常用酶类：辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP), 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP) 用于标记的酶的特性 酶催化反应形成的产物易于在光镜下观察 酶反应终产物是稳定的沉淀，不会从酶活性部位向四周弥散而影响组织学定位 较易获得纯的酶分子 中性PH值时，酶分子稳定 酶连接在抗体上，二者活性均不受影响 HRP底物: 过氧化物：过氧化氢 供氢体：二氨基联苯胺 (Diaminobenzidine,DAB) 3-氨基-9乙基咔唑 (3-amino-9- ethylcarbozole, AEC) DAB + H2O2 棕色； AEC + H2O2 紫红色 AP磷酸酯水解酶， 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基蓝四唑 (BCIP/NBT) 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基四紫唑 (BCIP/INT) NBT/BCIP 蓝紫色 INT/BCIP 棕红色或橘黄色 ABC法的优点：敏感性更高 ABC法的缺点： ①亲和素(鸡蛋白)中含有10%糖类，导致背景着色 ②亲和素的等电点约10左右，带较多的负电荷，导致纤维组织着色。 ③内源性生物素导致背景着色 ④亲和素中有4个结合点，其中一半与连接抗体结合，另一半与复合物结合，可降低其敏感性 。  (二)链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法 （Streptavidin-peroxidase method，SP法） 链霉亲和素替代ABC法中的亲和素-生物素复合物，形成链