临床分离mRSA中氨基糖苷类抗生素磷酸化酶的-中国药科大学学报.PDF

学 报 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　２０１０，４１（１）：８１－８５ ８１ 临床分离ＭＲＳＡ中氨基糖苷类抗生素磷酸化酶的 克隆表达与活性测定 １ １，２ １ １ １ １ 陈俊升 ，苏　敏 ，陈代杰 ，李继安 ，阚士东 ，邵　雷 １ ２ （上海医药工业研究院创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海２０００４０；华东理工大学生物工程学院，上海２００２３７） 摘　要　目的：从临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）中克隆氨基糖苷类抗生素磷酸化酶基因并异源表 达，建立其磷酸化反应的体外测活方法。方法：考察临床分离ＭＲＳＡ对氨基糖苷类抗生素的敏感性，从中克隆磷酸化酶基 因，并连入ｐＥＴ２８ａ构建表达载体和菌株，将表达的重组蛋白以亲和色谱分离纯化；使用ＥＳＩＭＳ以及抗菌活性实验测定其 磷酸化酶活性。结果：药敏实验表明临床分离的６株ＭＲＳＡ均对氨基糖苷类抗生素不敏感，重组表达克隆到的磷酸化酶， 表达产物纯化后的纯度大于９０％，体外催化试验表明，重组磷酸化酶２ｈ内可以催化反应体系内的卡那霉素Ｂ完全磷酸 化。结论：异源表达的氨基糖苷类抗生素磷酸化酶具有很好的活性，体外测活方法可靠快捷，为建立氨基糖苷类抗生素磷 酸化酶抑制剂筛选模型打下基础。 关键词　氨基糖苷类抗生素；耐甲氧西林金葡菌；磷酸化酶；异源表达 中图分类号　Ｑ７８　　文献标识码　Ａ　　文章编号　１０００－５０４８（２０１０）０１－００８１－０５ Ｃｌｏｎｉｎｇ牞ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｉｎｖｉｔｒｏａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓ ｆｅｒａｓｅｆｒｏｍｃｌｉｎｉｃａｌＭＲＳＡｉｓｏｌａｔｅｓ １ １牞２ １ １ １ １ ＣＨＥＮＪｕｎｓｈｅｎｇ牞ＳＵＭｉｎ 牞ＣＨＥＮＤａｉｊｉｅ牞ＬＩＪｉａｎ牞ＫＡＮＳｈｉｄｏｎｇ牞ＳＨＡＯＬｅｉ １ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮｅｗＤｒｕｇａｎｄＰｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｏｃｅｓｓ牞ＳｈａｎｇｈａｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙ牞Ｓｈａｎｇｈａｉ牞 ２ ２０００４０牷ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ牞ＥａｓｔＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ牞Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３７牞Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ａｉｍ牶Ｔｏｃｌｏｎｅａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｔｈｅｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ牗ＡＧ牘ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ牗ＡＰＨ牘 ｆｒｏｍｃｌｉｎｉｃａｌＭＲＳＡｉｓｏｌａｔｅｓｉｎＥｃｏｌｉａｎｄｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｎａｓｓａｙｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡＰＨＭｅｔｈｏｄｓ牶Ｔｈｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｏｆｃｌｉｎｉｃａｌＭＲＳＡｉｓｏｌａｔｅｓｔｏＡＧｓｗａｓｔｅｓｔｅｄｂｙｄｉｓｋｄｉｆｆｕｓｉｏｎＡｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｅｎｃｏｄｉｎｇ ＡＰＨｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆａｎｉｓｏｌａｔｅａｎｄｌｉｇａｔｅｄｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ２８ａ牞ａｎｄｔｈｅｎｔｒａｎｓ ｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｃｏｌｉＢＬ２１牗ＤＥ３牘Ａｆｔｅｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｂｙａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ牞ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｅｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＥＳＩＭＳａｎｄｄｉｓｋｄｉｆｆｕｓｉｏｎＲｅｓｕｌｔｓ牶Ａｌｌ６ｃｌｉｎｉｃａｌ ＭＲＳＡｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｕｎｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｔｏＡＧｓＡｆｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓ